新國(guó)標(biāo)應(yīng)對(duì)—GB 5009.35-2023 食品中 11 種合成著色劑的測(cè)定

引言

合成著色劑是人工合成的使食品著色和改善食品色澤的物質(zhì)[1]，具有色澤鮮艷、性質(zhì)穩(wěn)定、成本低廉以及著色力強(qiáng)等特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于各類食品中，如糖果、糕點(diǎn)、蜜餞、飲料、罐頭等。合成著色劑在現(xiàn)代食品工業(yè)中扮演著不可或缺的角色，賦予食品豐富的顏色，為消費(fèi)者呈現(xiàn)出多樣的選擇。然而，隨著人們對(duì)食品質(zhì)量安全的日益關(guān)切，因合成著色劑生產(chǎn)環(huán)節(jié)的濫用以及消費(fèi)環(huán)節(jié)的過(guò)量攝入而導(dǎo)致的一些列潛在危害，也引發(fā)了社會(huì)各界的廣泛關(guān)注和討論。

近期，食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)審評(píng)委員會(huì)審查通過(guò)并發(fā)布了 85 項(xiàng)食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，其中包含了合成著色劑的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)— GB 5009.35-2023。

GB 5009.35-2023 新國(guó)標(biāo)變化[2][3]：

1. GB 5009.35-2023 于 2023-09-06 正式發(fā)布，2024-03-06 正式實(shí)施；

2. GB 5009.35-2023 代替 GB 5009.35-2016、GB 5009.141-2016、GB/T 9695.6-2008、GB/T 21916-2008；

3. 相較于 GB5009.35-2016，GB 5009.35-2023 增加了靛藍(lán)、誘惑紅、酸性紅和喹啉黃 4 種合成著色劑，增加和明確了適用基質(zhì)種類，修改了樣品前處理方法和儀器條件，修改了檢出限和定量限。

賽默飛新國(guó)標(biāo)應(yīng)對(duì)方案亮點(diǎn)：

1. 賽默飛實(shí)驗(yàn)室完全參照標(biāo)準(zhǔn)梯度洗脫程序進(jìn)行方法復(fù)現(xiàn)，為進(jìn)一步優(yōu)化靈敏度和分離度，僅將柱溫提升至 35℃；

2. 檸檬黃和新紅、喹啉黃-5 與莧菜紅、喹啉黃-6 與胭脂紅、日落黃與喹啉黃-2、酸性紅與喹啉黃-3 均可基線分離，實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確定性和定量；

3. 酸性紅出峰位置在亮藍(lán)-1 之后，不會(huì)干擾亮藍(lán)-3 的定性定量，分離和保留效果優(yōu)于標(biāo)準(zhǔn)提供的參考譜圖；

4. 基于 Chromeleon 7.3 數(shù)據(jù)處理軟件，采用化合物組模式對(duì)喹啉黃和亮藍(lán)的多個(gè)異構(gòu)體進(jìn)行準(zhǔn)確定量，提升工作效率。

GB 5009.35-2023 賽默飛應(yīng)用解決方案

01儀器配置及色譜條件

液相色譜儀：Vanquish™ Core HPLC 液相色譜系統(tǒng)，配合變色龍數(shù)據(jù)處理軟件

色譜柱：

Acclaim 120 C18, 5 μm, 4.6×250 mm (P/N: 059149)

Betasil C18, 5 μm, 4.6×250 mm (P/N: 70105-254630)

四元泵 Pump: VC-P20-A

流動(dòng)相：A: 20 mM 乙酸銨  B: 甲醇

流速：1.0 mL/min

梯度洗脫程序：

自動(dòng)進(jìn)樣器 Sampler Module: VC-A12-A

進(jìn)樣量：10 μL；樣品盤(pán)溫度：15 ℃

柱溫箱 Column Comp: VC-C10-A

柱溫：35 ℃

檢測(cè)器 DAD: VC-D11-A (UV/Vis)

采集波長(zhǎng)：415 nm, 520 nm, 610 nm；

采集頻率：5 Hz；

光譜采集：400-800 nm

02譜圖及數(shù)據(jù)

2.1

Acclaim 120 C18 應(yīng)用于 11 種合成著色劑的分離

圖 1 415/520/610 nm 下，11 種合成著色劑分離疊加譜圖 (20.0 μg/mL, 10 μL)

圖 2 415 nm 下，檸檬黃和喹啉黃分離譜圖及數(shù)據(jù)  (20.0 μg/mL, 10 μL)

圖 3 520 nm 下，新紅等 7 種合成著色劑分離譜圖及數(shù)據(jù)  (20.0 μg/mL, 10 μL)

圖 4 610 nm 下，靛藍(lán)和亮藍(lán)分離譜圖及數(shù)據(jù)  (20.0 μg/mL, 10 μL)

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2.2

喹啉黃與亮藍(lán)異構(gòu)體的分離

2.2.1 喹啉黃異構(gòu)體的分離

食品添加劑喹啉黃是由 2-(2-喹啉基)-1,3-茚二酮 （Ⅰ型）或 三分之二 2-(2-喹啉基)-1,3-茚二酮和三分之一 2-[(6-甲基喹啉基)]-1,3-茚二酮的混合物（Ⅱ型）磺化而制得的。其中，Ⅰ型工藝產(chǎn)品主成分為 2-(2-喹啉基)-茚滿基-1,3-二酮二磺酸二鈉鹽 (≥80.0%)，2-(2-喹啉基)-茚滿基-1,3-二酮單磺酸鈉鹽 (≤15.0%)，2-(2-喹啉基)-茚滿基-1,3-二酮三磺酸三鈉鹽 (≤7.0%)，副染料 2-(2-喹啉基)-1,3-茚二酮 和 2-[(6-甲基喹啉基)]-1,3-茚二酮 (≤4.0%)；Ⅱ型工藝產(chǎn)品主成分為 2-(2-喹啉基)-茚滿基-1,3-二酮二磺酸二鈉鹽 (≥70.0%)，副染料 2-(2-喹啉基)-1,3-茚二酮 和 2-[(6-甲基喹啉基)]-1,3-茚二酮 (≤4.0%)[4]。由于在磺化反應(yīng)過(guò)程中取代位點(diǎn)的不同，使得 2-(2-喹啉基)-茚滿基-1,3-二酮二磺酸二鈉鹽 QYNa2 有兩種異構(gòu)體 QYNa2Ⅰ和 QYNa2Ⅱ，2-(2-喹啉基)-茚滿基-1,3-二酮單磺酸鈉鹽 QYNa 也有兩種異構(gòu)體 QYNaⅠ和 QYNaⅡ[5]。

因此，食品添加劑喹啉黃由于合成及純化工藝的差異，在色譜分離時(shí)會(huì)出現(xiàn)多個(gè)色譜峰，相同的發(fā)色基團(tuán)在 415 nm 下，最多可能有 7 個(gè)色譜峰；而標(biāo)準(zhǔn)品喹啉黃通常是經(jīng)色譜制備純化除去副染料，最多可能分出 5 個(gè)色譜峰。如圖 5 所示，喹啉黃的 7 個(gè)組分光譜圖高度相似，喹啉黃-1/2/3/4 與新國(guó)標(biāo)標(biāo)記的 4 個(gè)喹啉黃組分出峰順序及保留時(shí)間相一致，喹啉黃-5/6/7 可能是 QYNa3 或副染料成分，時(shí)常會(huì)因色譜分離不充分而被混標(biāo)中其他相鄰峰包埋，進(jìn)而被忽視。

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圖 5 415 nm 下，喹啉黃異構(gòu)體分離譜圖  (100.0 μg/mL, 5 μL)（點(diǎn)擊查看大圖）

2.2.2 亮藍(lán)異構(gòu)體的分離

食品添加劑亮藍(lán)的合成工藝路線是由一份苯甲醛鄰磺酸與兩份 N-乙基-N-(3-磺基芐基)-苯胺為原料經(jīng)縮合、氧化而制得[6]。其中，N-乙基-N-(3-磺基芐基)-苯胺系 N-乙基-N-芐基苯胺磺化而得，磺化位置主要在其芐基上的間位，其次對(duì)位，鄰位磺化則較難。由于難以分離故 N-乙基-N-(3-磺基芐基)-苯胺的工業(yè)品實(shí)際是三個(gè)異構(gòu)體的混合物，一般大致組成為間位物 (m) : 對(duì)位物 (p) : 鄰位物 (o)=75~85 : 15~20 : 0~8。因此，制得的亮藍(lán)商品色素其主成分亦應(yīng)是 m-m、m-p、m-o、p-p、p-o、o-o 6 個(gè)同分異構(gòu)體的混合物[7]。而 o-o 和 o-p 同分異構(gòu)體的占比非常低，市售工藝純亮藍(lán)的液相色譜圖通常會(huì)呈現(xiàn)出 4 個(gè)色譜峰。如圖 6 所示，亮藍(lán)的  4 個(gè)組分光譜圖高度相似，亮藍(lán)-1/2 與新國(guó)標(biāo)標(biāo)記的 2 個(gè)亮藍(lán)組分出峰順序及保留時(shí)間相一致，亮藍(lán)-3/4 在標(biāo)準(zhǔn)中被忽略掉了，其中亮藍(lán)-3 可能會(huì)受到酸性紅的干擾。

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圖 6 610 nm 下，亮藍(lán)異構(gòu)體分離譜圖  (100.0 μg/mL, 5 μL)（點(diǎn)擊查看大圖）

2.3

11 種合成著色劑標(biāo)準(zhǔn)系列工作液校準(zhǔn)曲線

圖 7 檸檬黃和喹啉黃 線性疊加譜圖 (0.20-10.0 μg/mL, 10 μL)

圖 8 新紅等 7 種合成著色劑 線性疊加譜圖 (0.20-10.0 μg/mL, 10 μL)

圖 9 靛藍(lán)和亮藍(lán) 線性疊加譜圖 (0.20-10.0 μg/mL, 10 μL)

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2.4

樣品及樣品加標(biāo)譜圖

圖 10 維生素功能飲料樣品及樣品加標(biāo)譜圖 （檸檬黃、胭脂紅有檢出）

圖 11 茉莉花茶樣品及樣品加標(biāo)譜圖

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2.5

喹啉黃和亮藍(lán)異構(gòu)體的定量

圖 12 喹啉黃和亮藍(lán)異構(gòu)體采用化合物組進(jìn)行定量示意圖

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Tips: 關(guān)于化合物組定量，想要了解更多變色龍軟件的操作細(xì)節(jié)？歡迎咨詢賽默飛液相色譜應(yīng)用團(tuán)隊(duì)

2.6

Betasil C18 應(yīng)用于  11 種合成著色劑的分離

（補(bǔ)充方案）

圖 13 Betasil C18 應(yīng)用于  11 種合成著色劑分離譜圖 (20.0 μg/mL, 10 μL)（點(diǎn)擊查看大圖）

03GB 5009.35-2023 相關(guān)色譜耗材推薦

參考文獻(xiàn)：

[1] GB 5009.35-2023 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中合成著色劑的測(cè)定

[2] GB 5009.35-2016 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中合成著色劑的測(cè)定

[3] GB 2760-2014 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)

[4] GB 1886.104-2015 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑 喹啉黃

[5] DBS32/ 012-2016 食品安全地方標(biāo)準(zhǔn) 食品中喹啉黃的檢測(cè) 高效液相色譜法、液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法

[6] GB 1886.217-2016 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑 亮藍(lán)

[7] 丁秋龍,王麗斌,陳建新. 食用亮藍(lán)色素之同分異構(gòu)體研究