基因組編輯在研究、醫療保健和農業方面有著強大的應用。然而，基因組編輯可能導致的各種分子反應事件的范圍被低估了，而且該技術在目標位點內外仍然無法預測。這對于為治療性基因編輯、農業和其他應用提供安全方法具有相當大的影響。預測和驗證基因組編輯的結果對于所有應用的成功至關重要。

Cas9 誘導的雙鏈斷裂導致一系列預期和意外的結果。終的編輯結果導致小的插入、刪除或染色體易位或不完整的模板整合。

通過各種努力，我們已經采用了多種方法來驗證正確的基因編輯并確保未發生針對目標的意外編輯事件。通常的分子方法是通過 Sanger直接DNA 測序或 PCR擴增子的 NGS ，其大小通常小于 1000 bp。

其他常見方法包括 T7核酸內切酶1 (T7E1) 錯配檢測分析、通過分解跟蹤插入缺失 (TIDE) 分析和通過擴增子分析 (IDAA) 檢測插入缺失、克隆 PCR 擴增子然后測序，但偶爾也包括全基因組測序(WGS)、陣列比較基因組雜交 (CGH)、Southern 印跡、Fiber-FISH 和 FISH。

大多數情況下，這些方法僅提供有關基因編輯位點周圍有限區域的信息，不會捕獲來自 CRISPR/Cas誘變效應的整個序列，尤其是不會檢測更大的缺失。為此Kosicki 等人在Nat. Biotechnol上發表的《Repair of double-strand breaks induced by CRISPR–Cas9 leads to large deletions and complex rearrangements》論文，強調了將分子分析擴展到包括 CRISPR-Cas9 誘導的 DSB 位點周圍的幾千堿基的重要性，并展示了長讀長測序如何可以高分辨率的分析基因編輯的準確性。

在這里，我們也推薦一種新的間接序列捕獲技術 (Samplix Xdrop®) 的應用，用于富集長基因組DNA 片段，以通過長讀長和短讀長測序分析 CRISPR-Cas9 編輯細胞中的基因型和等位基因狀態 。該論文名為《Verification of CRISPR editing and finding transgenic inserts by Xdrop Indirect sequence capture followed by short- and long- read sequencing》。

該研究中，研究人員通過Xdrop技術在一組 CRISPR 修飾的誘導多能干 (iPS) 細胞系中檢測到 CRISPR-Cas9 誘導的意外基因編輯。 盡管使用其他幾種互補方法進行了全面分析，但早期驗證 CRISPR 編輯的嘗試并未檢測到這些意外編輯。

在這項研究中，他們還證明用于評估 CRISPR-Cas9 基因組編輯事件的基于 PCR 的標準程序無法提供足夠準確的驗證。CRISPR 編輯的驗證應基于對更大區域的檢查。

Xdrop方法所檢測序列的位置可能與主要感興趣區域（如基因編輯位點）相距 5-10 千堿基 (kb) 或更遠。

其實驗過程是在將高分子量 (HMW) DNA 、PCR 試劑和引物分配到雙乳液液滴內并進行反應后，含有目標 DNA 的液滴通過液滴 PCR識別，然后用 DNA 嵌入熒光染料進行染色。

只有含有來自感興趣區域 (ROI) 的 DNA 的液滴才會產生檢測序列擴增子并發出熒光。由于雙乳液液滴的大小和組成，這些可以在標準流式細胞儀細胞分選儀上進行分類，以富集熒光液滴。

然后分離含有長 DNA 片段的液滴，并通過液滴中的單分子多重置換擴增(dMDA) 進行擴增。dMDA 的擴增能力能夠從 6 pg 的輸入 DNA 中產生約 1.5 μg 的擴增 DNA，并且對大于 5 kb 的分子比較理想。由此產生的富集 DNA 與短讀長和長讀長測序平臺兼容。

Xdrop間接序列捕獲方法可采用距基因編輯位點 5–10 kb 或更遠的距離設計的引物，它在高深度測序提供了大約 100 kb 長的區域的序列讀取覆蓋。這允許對基因編輯站點周圍區域中潛在的意外編輯進行調查。Xdrop技術展示了如何在事先不了解其基因組整合的情況下也能夠識別轉基因插入位點。

如果您想Samplix的Xdrop高保真基因擴增和驗證技術有更多的了解，請聯系我們。

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