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A. DNA模板：
· 盡量使用高質量、純化后的DNA作為模板
· 需要提高保真度時，可使用較高的DNA模板濃度并減少循環(huán)數(shù)
· 模板用量：以50 μl反應體系為例——
人基因組DNA：0.1~1.0 μg
大腸桿菌基因組DNA：10~100 ng
Lambda DNA：0.5~5 ng
質粒或病毒DNA：0.1~10 ng
B. 引物設計原則：
· 引物長度要滿足特異性需要，一般可在18~25個堿基之間；擴增長片段時最好在24~30個堿基之間；
· 當引入克隆位點時，引物末端應額外增加3個以上堿基；
· (G+C)%含量應盡量控制在40~60%，兩條引物的(G+C)%含量應盡量接近；
· 引物中GC堿基分布均勻；
· 盡量避免相同堿基連續(xù)出現(xiàn)三次以上，3’端應避免使用A或T；
· 避免引物內(nèi)部自身配對形成二級結構；
· 正反向引物之間應避免配對堿基，尤其是3’端的三個堿基，否則易生成引物二聚體(Primer dimer)；
· 兩條引物的解鏈溫度（Tm）值應在42~65℃之間，而且兩條引物間最好相差不超過5℃；
· 引物Tm值的計算方法：
20 nt以下：Tm = 2℃ x (A + T) + 4℃ x (G + C)
20 nt以上：Tm = 81.5 + 0.41 x (GC%) -600/nt (nt：引物的堿基數(shù))
· 引物用量：
· 0.1~1.0 μM，通常可以0.2 μM起始，根據(jù)體系不同調(diào)整用量；
· 使用簡并引物、隨機引物時，需增加引物總量以彌補產(chǎn)量損失；但隨著引物量加大，特異性將降低；
· 模板較大較多，或結構較復雜(如人基因組DNA)時，需減少引物用量以提高特異性；
· 模板較小較少(如質粒模板)時，增加引物用量可提高產(chǎn)量。
C. 核苷酸（dNTPs）：
· 常規(guī)dNTPs濃度為每種核苷酸0.1~1.0 mM，通常可以0.2 mM起始，根據(jù)體系不同調(diào)整用量；
· 低濃度（0.05~0.1 mM）可增加保真性，但會降低產(chǎn)量；
· 高濃度提高產(chǎn)量，尤其是長片段PCR，但會降低保真度。
D. 鎂離子濃度
· 對于Taq DNA聚合酶，鎂離子的最佳濃度為1.5~2.0 mM；
· 最佳濃度取決于模板、緩沖液、DNA和dNTPs（每一種都有可能鰲合鎂離子）；
· 鎂離子濃度過低，會降低產(chǎn)量；
· 鎂離子濃度過高，會增加非特異性PCR產(chǎn)物；
· 優(yōu)化鎂離子濃度時，通常以0.5 mM梯度遞增，最高到4 mM。
E. Taq DNA 聚合酶濃度
· 推薦使用濃度為 1~2.5 U/50 μl反應體系。
F. 起始反應
· 在冰上配制反應體系；
· 最后加聚合酶；
· 將熱循環(huán)儀預熱至變性溫度(94℃)后，放入PCR管，立即進行反應。
G. 變性溫度與時間
· 通常于94℃初始變性，使DNA雙鏈全打開；
· 變性時間通常為15~30秒；
· 避免長時間或高溫度孵育；
· 高GC含量模板可提高變性溫度至98℃。
H. 退火溫度與時間
· 通常情況下，退火溫度為引物Tm值減5℃，在55~60℃之間；
· 提高退火溫度有利于減少非特異性條帶；
· 常規(guī)退火時間為15~30秒。
I. 延伸溫度與時間
· 延伸反應通常在72℃下進行。
· Taq酶的延伸時間大約為15~30秒/kb DNA；
· 產(chǎn)物小于1 kb時，建議延伸時間為30~60秒；
· 產(chǎn)物大于3 kb或反應超過30個循環(huán)時，可能需要更長的延伸時間。
典型的循環(huán)條件：
預變形94℃ 2 分鐘
94℃ 30秒，
55℃ 30秒，
72℃ 1分鐘/1 kb，25~30個循環(huán)
72℃ 5分鐘
注：上述反應條件適用于普通Taq DNA聚合酶催化的PCR反應。當DNA模板富含GC、具有復雜二級結構、低濃度或產(chǎn)物>5 kb時可能需要改變相應條件
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