1.  方法驗證

分析方法驗證是證明分析程序適合其預期目的的過程⁵。并非所有驗證特征都適用于粒度分析。較早的 FDA 工業指南（非實施）草案文7包括一個專門針對粒度分析的部分。盡管較新的已發布文件取代了較舊的指南草案，但有關粒度分析的較舊部分提供了有關粒度分析與其他技術（如 HPLC）的不同之處的見解。舊文檔中的以下聲明有助于方法驗證工作：

“方法驗證通常涉及中間精度和重復性的評估。應保證生成的數據是可重復的，并控制產品的質量。”⁷

考慮到這一評論，下面提供了解決 DLS 方法驗證的建議：

● 特異性：N/A，DLS 檢測大小變化但對不同化學物質不敏感。

● 線性：N/A，DLS 沒有任何線性關系。

● 準確性：N/A，儀器的準確性使用標準粒子進行驗證，但常規定量裁判方法（SEM/TEM 顯微鏡）不包括準確性確定。包括樣品的 SEM/TEM 圖像以支持方法驗證可能是更合適的。

● 精密度（重復性、中間精密度和重現性）：這是需要重點關注的地方。通常這些術語的定義在粒度分析領域可能不同于其他技術。以下評論來自粒度分析領域：

    重復性：多次測量樣品。

    重現性：準備樣品、測量、丟棄、清潔、重復。建議的方法是制備五份樣品，然后對每個樣品進行五次分析。

    中間精密度：此活動涉及第二位分析員、第二臺儀器或兩者兼而有之。如果所有測試都在一個地點進行，則由同一系統上的不同操作員在不同日期分析同一批次的樣品。如果要在多個地點進行測試，則同一樣本（或批次）由不同操作員在不同地點的不同系統上進行分析。

● 范圍：N/A，僅在所用系統的工作范圍內工作。無需對此進行測試或記錄。

● 定量限：N/A，這只是測試粒徑。

● 檢測限：N/A，方法開發應確保樣品在系統檢測限內。

2.  結構示例

兩名操作員在兩個 Nicomp DLS 系統上分析了一種藥物物質（異丙酚乳劑）。該樣品已過期，但仍顯示符合 USP<729>的合格結果。儀器設置如下：

Instrument A：

Instrument B：

3.  方法開發

首先分析 92 nm PSL 標準以確保適當的系統性能。測量結果在預期值的 98% 以內。建議在開始此類工作之前進行此驗證測試。

接下來進行快速研究以測試濃度（稀釋）的影響。參見圖 1 中的結果。

遵循這些指南的內容，DLS 規格（根據定義尺寸小于 10 µm）對于強度平均值可以是可重復的 ±20%，對于 PI 或其他計算結果指示分布寬度是可重復的 ±30%。對于某些藥品，這可能是一個可以接受的范圍，但要注意當粒徑非常小時出現的統計問題。如果平均粒徑為 500 nm，±20%，則范圍為 400 – 600 nm，這還不錯。但對于平均粒徑為 10 nm 的蛋白質，范圍則為 8-12 nm，這樣的粒徑跨度變得非常挑戰且難以接受。

將 10 滴樣品加入 15 mL 去離子水中并進行分析。重復相同的制備。然后將這些樣品按 2:1 稀釋并進行分析。樣品看起來太渾濁，結果發生變化，因此將下一滴添加到 15 mL DI 水中。樣品出現輕微混濁，這些結果是可以接受的。有時，稀鹽溶液是比純去離子水更好的稀釋劑。下一步是將一滴樣品加入 10 mL 過濾后的 10 mM KCl 溶液中。這些結果似乎更好，因此 10 mM KCl 溶液用于本研究中的所有其他測量。

在進行稀釋研究時，分析時間也從3分鐘到10分鐘不等。三分鐘、五分鐘和十分鐘分析時間的時間曲線圖如圖2-4所示。紅色=光強粒徑平均值，藍色=體積粒徑平均值，藍色=數量粒徑平均值。

該方法選擇了5分鐘的分析時間。在五分鐘的分析時間完成之前，光強平均粒徑結果已經穩定下來。但直到大約9分鐘前，體積和數量加權平均結果仍在變化。這是也是在使用DLS時僅選擇光強粒徑結果的一個原因。這可能是方法開發中測試重復性很好的一個點。在這種情況下，也許下一個測試的分析時間是四分半、五分和五分半鐘。在這項研究中沒有執行這一步驟，值得指出的是，整個方法開發和驗證研究在不到8個小時內完成。更嚴格的最終發布測試方法開發和驗證方法很可能需要至少幾天時間。

4.  樣品準備

——在干凈的瓶子里裝滿10毫升過濾后的KCl溶液

——用針頭注射器取出0.5毫升異丙酚

——在瓶子里注入1滴異丙酚和10毫升KCl溶液

——手旋轉直到混合(10秒)

——用一次性移液管將400μL樣品移入圓形一次性玻璃樣品池

——將玻璃樣品池放入黑色Holder支架·在Nicomp上打開樣品蓋

——將樣品池和支架插入Nicomp系統，Holder支架背向Nicomp的左側

——關閉Nicomp上的樣品蓋

確保儀器設置與如下所示的值匹配：

——單擊綠色“G”圖標開始測量

——打印并記錄平均直徑、標準偏差、PI 、D10、D50 和 D90

——將結果輸入 Excel 電子表格

——計算五項分析的平均值和變異系數

——比較兩個數據集

5.  結果

樣品在 A 和 B 系統上獨立制備和分析。每個樣品分析五次以檢查重復性。這兩個系統的示例結果如圖 5 和圖 6 所示。

整個結果以表格形式顯示在圖 7 和圖 8 中。五個結果的疊加如圖所示。

6.  結論

查看綜合結果可以得出以下幾點觀察結果：

——即使是相隔數年生產的兩個系統也會生成相似的數據

——兩個系統之間存在明顯的 3% 偏差

——PI計算可能不是用于定義寬度分布的最佳值

——如果使用PI，則30%的差值似乎是合適的

——D10、D50、D90 結果顯示出更好的重現性，可能更容易為制藥行業所接受

純粹基于該數據集，基于三個測量的該藥物產品的規格可能類似于：

——光強平均值 = 200 nm ±20%，COV = 小于 20%

——D10 = 140 nm ±30%，COV = 小于30%

——D90 = 284 nm ±30%，COV = 小于 30% 或

——PI = 0.09 ±30%

上述建議規格僅來自觀察到的重現性，可能對藥物安全性或有效性沒有任何影響。USP<729>中的實際是否通過標準的要求只是粒徑尺寸必須低于 500 nm 并且具有低x2值。質量標準的另一種方法可能是關注影響有效性和/或安全性的粒徑大小。本技術說明收集的數據是讓您了解 DLS 技術對于簡單樣品的可重復性/重現性

7.  儀器介紹

參考資料

1 USP<729>, Globule Size Distribution in Lipid Injectable Emulsions

2 ISO 22412 Particle size analysis — Dynamic light scattering (DLS)

3 USP<429>, Light Diffraction Measurement of Particle Size

4 Entegris Technical Note, DLS Sample Preparation

5 Analytical Procedures and Methods Validation for Drugs and Biologics, July 2015

6 Entegris Technical Note, DLS System Verification

7 Guidance for Industry, Analytical Procedures and Methods Validation, Draft Guidance, July 2000. No longer available for download at FDA website.

8 Entegris Technical Note, DLS Data Interpretation