1.  引言

動(dòng)態(tài)光散射 (DLS) 是檢測蛋白質(zhì)粒徑的標(biāo)準(zhǔn)工具，但該方法不提供濃度信息。AccuSizer® 單粒子光學(xué)傳感技術(shù) (SPOS) 系統(tǒng)可用于檢測聚集蛋白粒徑和濃度，可測量150nm以上的聚集蛋白濃度。圖 1 顯示了單抗產(chǎn)品熱應(yīng)激前后的 Nicomp® DLS 結(jié)果。

加熱后的結(jié)果（藍(lán)色）顯示了高分辨率的多峰結(jié)果，包括從~150 nm開始的較大的聚集峰。AccuSizer 無法檢測到 10 nm 的顆粒，但可以提供 >150 nm聚集蛋白的定量數(shù)據(jù)。在這項(xiàng)研究中，AccuSizer FX Nano 用于研究各種配方穩(wěn)定化學(xué)物質(zhì)如何影響NIST標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的最終聚集狀態(tài)。AccuSizer FX Nano也可用于 USP <787> 亞可見顆粒物測試¹。

2.  材料

使用的蛋白質(zhì)是 NIST 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì) 8671，批號(hào) 14HB-D002，NIST mAb，人源 IgG1k 單抗²。在Nicomp動(dòng)態(tài)光散射(DLS)系統(tǒng)上，使用35mw激光二極管源，APD檢測器測量蛋白質(zhì)的初次粒徑。在配備兩個(gè)傳感器的AccuSizer FX Nano SIS系統(tǒng)上測量蛋白質(zhì)聚集體:LE-400; 0.5 – 400 μm 和 FX Nano; 0.15 – 10 μm.SIS進(jìn)樣器提供精確的樣品體積，最小進(jìn)樣量低至100 μL且可回收。

iFormulate³（圖 2）板預(yù)裝了配方，由 DoE 設(shè)計(jì)用于合理的配方開發(fā)，用于測試配方的聚集水平。評(píng)估了蛋白配方的四個(gè)主要影響因素；pH、離子強(qiáng)度、緩沖液和穩(wěn)定劑濃度。

使用的 iFormulate 板測試了以下影響因素：

• pH：5 – 7.6

• 離子強(qiáng)度：0 – 200 mM NaCl

• 海藻糖穩(wěn)定劑：0 – 10 %

• 緩沖液濃度：10 – 50 mM

3.  方法

將 NIST mAb 解凍并稀釋至 1 mg/mL，將 160 μL 過濾的去離子水添加到 iFormulate 板的每個(gè)孔中。每孔加入40 μL NIST mAb。將培養(yǎng)皿置于60°C(剛好低于蛋白質(zhì)熔點(diǎn))的烤箱中24小時(shí)。使用 AccuSizer 顆粒計(jì)數(shù)器分析每個(gè)孔。將>0.15 μm(總)和>0.53 μm的顆粒計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)提交給iformula，由iformula進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和穩(wěn)定性建模。

4.  結(jié)果

數(shù)據(jù)使用帕累托分析方法處理，帕累托分析方法在多影響因素下十分有效。帕累托分析給出了影響因素排名和影響因素之間的相互作用。圖 3 和圖 4 分別顯示了 >0.15 μm 和 >0.53 μm 的帕累托分析。顏色表示配方變量對(duì)增加的顆粒計(jì)數(shù)的相對(duì)重要性，藍(lán)色 = 重要，灰色 = 臨界，紅色 = 不太重要。

下面的結(jié)果顯示了不同條件下聚集效應(yīng)的 3D 響應(yīng)曲面圖。這種設(shè)計(jì)空間提供了通過檢測在兩個(gè)粒徑范圍內(nèi)顆粒濃度的方法，以此來確定可最大限度減少聚集配方。圖 5 和圖 6 顯示了在保持緩沖液和 NaCl 濃度不變的情況下，改變 pH 值和穩(wěn)定劑（海藻糖）的結(jié)果。

圖5 pH值和穩(wěn)定劑的影響>0.15μm

圖6 pH值和穩(wěn)定劑的影響>0.53μm

圖 7 和圖 8 顯示了不同 NaCl 和穩(wěn)定劑（海藻糖）濃度的結(jié)果，同時(shí)保持緩沖液濃度穩(wěn)定且 pH 值從 5.91 略微變化到 6.3。

圖7 NaCl和穩(wěn)定劑的作用>0.15μm

圖8 NaCl和穩(wěn)定劑的作用>0.53μm

然后對(duì)這些結(jié)果以及此處未顯示的其他結(jié)果進(jìn)行整理，圖9和圖10顯示了最小粒子數(shù)優(yōu)化圖。

圖9 顆粒最小化圖>0.15μm

圖10 顆粒最小化圖>0.53μm

5.    結(jié)論

此處顯示的結(jié)果表明，可減少顆粒計(jì)數(shù)并因此減少蛋白質(zhì)聚集的最佳化學(xué)制劑為：

pH = 6.1 – 6.3

NaCl = 40 – 70 mM

海藻糖 = 7 – 8%

緩沖液 = 50 mM

AccuSizer也可用于在≥10和25μm的條件下進(jìn)行USP＜787＞測試，并可使用A2000 USP微孔板分析儀實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化。

參考資料

[1] USP <787>, Subvisible Particulate Matter in Therapeutic Protein Injuctions, see usp.org 

[2] NIST reference material 8671, Lot 14HB-D-002, NIST mAb

[3] iformulate

[4] AccuSizer A2000MPA