調料九里香保衛細胞壁與新鮮馬鈴薯塊莖新局部化淀粉粒的顯微偏振測定分析

偏振光顯微鏡（PLM）已經成為地質學和材料學領域的常用工具，它通過使用典型的石英楔補償器、云母1/4波片和Sénarmont補償，在礦物組成和復合材料（如纖維）結構的測定方面有著舉足輕重的作用[1]。上述設備更復雜的組合方式，或涉及利用定量偏振（借助Berek補償器或Br?ce-K?hler補償器）測定單個各向異性晶體或材料的雙折射?；蛘?，可以通過對參照Michel Lévy色表觀察到的消光帶和光譜進行比較，（事先推斷延遲點的樣品厚度）用紅I（λ）波片測定透射光波的延遲量（以闡明上述結構的雙折射）[2]。 

盡管如此，目前PLM在生物結構分析和亞細胞器研究應用上的相對重要性已經下降。相反，基于熒光顯微鏡技術的方法在生物科學領域的相對重要性得以提高，因為人們充分認識到反射熒光技術（又稱超分辨率顯微鏡技術）在突破阿貝分辨率極限上的作用，而且標記物在熒光蛋白組學成像中廣泛應用、使用方便。在本篇短文（希望它短小精悍）中，我們嘗試評估顯微偏振測定法（傳統定量PLM的外推方法）在闡明與鑒別保衛細胞壁超微結構和淀粉粒形態（所述淀粉粒從新鮮馬鈴薯塊莖樣品中分離）方面的應用。我們還希望，此后顯微偏振測定法作為一種分析技術的優勢將得到認識，并隨著生物科學和生物影像信息學領域的發展而進一步增強。可以想象，顯微偏振測定法與反射熒光技術結合，將在這種背景下形成共振，因為可以通過偏振鏡納米測量技術[自行設計但非?？扇〉脑坏鞍踪|組學分析的概念，通過整合定量偏振光顯微鏡（qtPLM）和當今的（或未來的增強版）超分辨率光學納米顯微鏡技術平臺可能會實現]的解釋實現外推。

材料與方法

以新局部化淀粉粒新鮮樣品（從馬鈴薯塊莖橫切面中分離）為本次評估的陽性對照，源于其來源豐富、易于制備[對于透射明視野（BF）和PLM技術而言]、雙折射程度高且結構充分表征的特點。將其與新鮮制備的調料九里香（M. koenigii）下表皮（本文稱為遠端表皮）載玻片（通過反射PLM觀察）進行對比，并以市售骨骼肌原纖維載玻片（雙折射程度極低，一般無法通過Berek和de Sénarmont補償進行解析）為qtPLM的陰性對照（本文不包括該載玻片的觀察結果）。以HC PL Fluotar 50X/0.80 BD物鏡（徠卡產品代碼：566504）結合旋轉分析器和聚光鏡集成偏振片（用于投射偏振）或者對應的入射光偏振片和史密斯反射立方體（用于反射偏振），進行樣品的各向異性鑒別。由于所分析的樣品大體具有高度雙折射特點，因此利用傳統的Berek補償器進行偏振度定量分析和對象延遲量測定，不過樣品的對象延遲量（Γobj）以另外一種方法予以量化（與利用單色光測定Γobj的傳統方法相反）。（但是）本短文中de Sénarmont和Br?ce-K?hler補償方法并未用于Γobj或雙折射率量化。

結果

圖1：透射明視野偏振光下未使用補償器（A）及使用相應Berek補償器（B）獲得的馬鈴薯塊莖淀粉類圖像。淀粉粒存在明顯的雙折射現象，其Γobj=168.12nm。

圖2：A：反射明視野偏振光下未使用相應Berek補償器獲得的調料九里香保衛細胞（具有內陷氣孔）圖像。保衛細胞纖維素細胞壁出現橙色和黃色多色性（分別以藍圈和綠圈標出），背景為綠黃色的細胞溶質（Γobj=52.69nm）*注：有趣的是，斯托克斯位移拉曼散射和磷光可能被視為解釋這種現象的替代假說，在后者中，已經發現纖維素具有自發熒光現象，在λ=420～430nm處出現最大發射值[3]）。B：Berek補償PLM成像的保衛細胞細胞壁立體圖。在細胞壁外圍觀察到比中部切片更密的纖維素微纖維分布（比如，是標藍圈的保衛細胞對的57%/40%=1.425倍）。

討論

正如我們所料，結果表明馬鈴薯淀粉粒和保衛細胞纖維素細胞壁在雙折射上存在差異。纖維素和直鏈淀粉（在其被分析的結構中）均以雙折射型多糖大纖維的形式出現；各微纖維的空間排列負責使E光相對于O光移相的距離（Γobj），因此對所形成的E矢量場的旋度（?×E）產生影響，如下面等式?和?所示（假設一個呈正弦曲線形式變化的常數B）。

假如從樣品發出的E光和O光振幅（A）相同，其E場分別表示為y軸和z軸。那么，明確具有雙折射特點的樣品[常數λ和外部補償（若有）為Γcomp]：

其中x表示偏振波在途中經過樣品時移動的距離，Γoc=Γobj+Γcomp。

這樣一來，（利用自行設計且與背景相關的（但具有廣義性）、用于在R3.5中確定雙折射率的公式）可以推導出?×E，如下所示：

其中可以假定光子的量子空間跳躍分別從y1和z1到y2和z2（其中y1→y0+，z1→z0+，y2→y0-，z2→z0-，Ay或Az=A）。

從上面的等式?可知，在R3.5中?×E的圖是一個曲線超平面，Γoc在?×E中沿著w軸引入相前平移。正如我們所料，這在視覺上表現為被分析的透射光波（具有不同的Γoc）的交替放大/消光；因此，隨后從?×E圖獲得的w截面可確定dim（?×E）且Γcomp已知的Γobj。但是，如果λ和Γoc可變（常見的例子是在qtPLM下觀察其結構具有不同雙折射率的多色照明樣品，比如圖1和圖2分別顯示的淀粉粒和保衛細胞纖維素細胞壁），那么我們可以推測，對于λ1..n中確定的λa及Γcomp1..n中確定的Γcompa，Γcompa處的dim（?×E），這樣便可解釋樣品中觀察到的多色性（負衰減的結果）。

此外，通過單獨測定Γobj和量化圖2中觀察到的多向色分布，或許可以推斷，被評估的保衛細胞纖維素細胞壁中主要β（1→4）-糖苷鍵的相對順序與氣孔長軸相平行（與皮層微管一樣），表明這些細胞里纖維素合成酶GT結構域的取向[4]在一定程度上與氣孔短軸相垂直。這與使用顯微偏振測定法確定圖1中淀粉粒α（1→4）-糖苷鍵徑向取向形成鮮明對比（這里直鏈淀粉為主要成分）。

結論

文獻表明，上個世紀五十年代至七十年代開展的大量研究中，均涉及顯微偏振測定法在生物分析方面的應用[5],[6]。然而，過去幾十年偏振光顯微鏡技術（作為促進生物學研究的要素）的相對重要性已經減弱，而熒光顯微鏡技術作為一種生物成像平臺正在興起，并隨著超分辨率光學顯微鏡技術和SIM等的發展而進一步發展。但與需要特定熒光生物標記（如共聚焦激光掃描顯微鏡技術和目前的光學納米顯微鏡技術中所應用的）和/或掃描/光場技術的情形不一樣，生物PLM為了解未解析分子結構中可能存在的異常提供了一個途徑。不過，創建含有關鍵熱點蛋白質（如p53和PrPSc[7]等）新雙折射值的數據庫，可能需要掌握大量的專業知識和進行大量的工作。因此，在這方面，透射和反射PLM的復興將相得益彰，其中顯微偏振測定法可用作傳統qtPLM方法的外推法。

參考文章