在進行細胞培養時，首先要對新鮮取材的動物組織等進行處理，或用機械的方法，或用胰蛋白酶、膠原蛋白酶等處理一段時間，將組織分散成單個細胞即原代培養。在進行傳代培養時，貼壁細胞需要重新用胰蛋白酶等處理，使之分散成單個的細胞。那么“胰蛋白酶”和“膠原蛋白酶”到底有什么區別呢？我們在細胞培養時應該如何選擇？

盡管胰蛋白酶和膠原蛋白酶都是細胞培養中常用于將體積較小的組織塊分散成細胞團或單細胞的消化液，但它們的作用機制及適用情況并不相同。

一、胰蛋白酶的作用特點

胰蛋白酶分離自牛、豬等動物的胰，作用于與賴氨酸或精氨酸相連接的肽鏈，除去細胞間黏蛋白及糖蛋白，從而使細胞分離，是應用廣泛的消化物，適用于消化細胞間質較少的軟組織，如胚胎組織、羊膜、上皮組織、肝、腎等軟組織以及傳代細胞等。胰蛋白酶的消化作用與酶的濃度、pH、溫度、組織塊的大小以及組織的硬度都有關系。胰蛋白酶濃度過大或消化時間太長，會導致細胞被消化；但反之消化不充分也達不到分散細胞的目的。此外，血清明顯抑制胰蛋白酶的活性，Ca²⁺和Mg²⁺對胰蛋白酶的活性有一定抑制作用。

根據細胞類型和實驗目的，可選用含/不含EDTA或酚紅的胰蛋白酶，其作用如下：

EDTA（乙二胺四乙酸）：胰蛋白酶中的EDTA主要起到螯合金屬離子，使細胞更容易分散的作用。 EDTA可以螯合Ca²⁺ 或Mg²⁺，而細胞表面很多和培養皿或培養瓶結合的蛋白都是帶有Ca²⁺ 或Mg²⁺的，把這些離子螯合后，可以加速細胞和培養皿的脫離，促進消化。EDTA是2價陽離子螯合劑，所以能螯合鈣、鎂等離子。上皮類細胞的連接存在“橋粒”結構，是細胞間最“牢固”的連接，但橋粒的形成依賴于鈣離子的存在。在胰酶消化細胞時，加入EDTA，可以破壞細胞的橋粒結構，使細胞能夠分散成單個細胞。通俗地說，就是破壞細胞間的粘連。

酚紅：胰蛋白酶中的酚紅主要是起到PH指示劑的作用。胰蛋白酶的最佳活性在7至9的pH范圍內實現。在此范圍內的酚紅呈粉紅色。由于環境條件，胰蛋白酶的pH可能變為酸性，呈橙色并使胰蛋白酶的效果降低。使用NaOH調節pH至7.4-7.6可以優化胰蛋白酶活性。研究表明，酚紅可以模擬固醇類激素的作用（特別是雌激素）。為避免固醇類反應，培養細胞尤其是哺乳類細胞時，用不加酚紅的培養基。由于酚紅干擾檢測，一些研究人員在做流式細胞檢測時，不使用加有酚紅的培養基。

濃度：一般常用胰酶的工作濃度為0.25%，而半貼壁細胞或對胰酶敏感的細胞常采用低濃度（0.05%）的胰酶進行細胞消化。

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貼壁細胞消化實驗方案：

（1）吸去培養液，用無菌的PBS、Hanks液或無血清培養液洗滌細胞一次，以去除殘余的血清。

（2）加入少量胰蛋白酶消化液，蓋過細胞即可，室溫放置1-2分鐘。不同的細胞消化時間有所不同，對于貼壁牢固的細胞可適當延長消化時間。

（3）顯微鏡下觀察，細胞明顯收縮，并且肉眼觀察培養器皿底部發現細胞的形態發生明顯的變化；或者用槍吹打細胞發現細胞剛好可以被吹打下來。此時吸除消化液。加入含血清的細胞培養液，吹打下細胞，即可直接用于后續實驗。

（4）如果發現消化不足，可加入胰蛋白酶消化液重新消化。

（5）如果發現細胞消化時間過長，未及時吹打細胞，細胞已經有部分直接從培養器皿底部脫落，直接用胰酶細胞培養液把細胞全部吹打下來。1000-2000g離心1分鐘，沉淀細胞，盡量去除胰酶細胞消化液后，加入含血清的培養液重新懸浮細胞，即可用于后續實驗。

組織的消化：不同的組織需要消化的時間相差很大，通常以消化后可以充分打散組織為宜。

二、膠原蛋白酶的作用特點

膠原蛋白酶是能在一定的pH和溫度下切割膠原蛋白主體螺旋多肽鏈的酶類，主要用于水解結締組織中的膠原蛋白，適于消化纖維性組織、上皮組織以及癌組織等。當擬消化的組織較硬，內含較多的結締組織或膠原成分時，用胰蛋白酶解離細胞效果較差，可采用膠原酶解離細胞法。鈣、鎂離子以及血清不會影響膠原酶的消化作用，其消化作用緩和，且無需機械振蕩。

目前商業化的膠原酶因所含組分的差異分為五類，其在應用上具有一定區分：

（1）膠原酶Ⅰ型：含有比較均勻的各種酶活力（包括膠原酶、酪蛋白酶、梭菌蛋白酶、胰蛋白酶活性），通常用作上皮細胞、肝、肺、脂肪和腎上腺組織細胞的制備。

（2）膠原酶Ⅱ型：比I型膠原酶含更高的梭菌蛋白酶活性，通常用作心臟、骨、肝、甲狀腺、唾液腺和軟骨等組織的原代細胞制備。

（3）膠原酶Ⅲ型：含較低的次級蛋白酶污染物水解活性，但具典型的膠原酶活性。常用于乳腺組織的原代細胞制備。

（4）膠原酶Ⅳ型：含較低的胰酶活性以降低對膜蛋白和受體的損害，通常用于胰島細胞制備，和維持受體完整性比較重要的其他研究，也可用于髓系細胞制備。

（5）膠原酶V型：含更高的膠原酶和酪蛋白活性，更低胰酶水平以降低對膜蛋白和受體造成損傷。適用于胰島制備。

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