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本期，我們聚焦DNA羥甲基化。DNA羥甲基化是近年發現的一種新的DNA修飾并迅速成為研究熱點。隨著研究的深入，發現之前被認為是檢測DNA甲基化“金標準”的重亞硫酸鹽測序并不能區分DNA甲基化（5mC）和DNA羥甲基化（5hmC）。易基因聯合劍橋大學建立了化學氧化法結合重亞硫酸鹽轉化的測序技術（oxidative bisulfite sequencing, oxBS-Seq），該技術不僅可以精確檢測DNA甲基化，排除DNA羥甲基化的影響，還可以雙文庫結合同時單堿基分辨率精確檢測DNA羥甲基化。該方法非常適合用于需要對DNA甲基化和羥甲基化進行區分的研究測序分析。

oxBS-Seq技術原理

近日，西南民族大學Jincheng Zhong團隊與西藏農牧畜牧獸醫研究所Jinwei Xin團隊利用oxRRBS+RRBS技術揭示了牦牛下丘腦在神經調節和髓鞘形成中的表觀遺傳調控機制。該研究成果于2021年9月27日發表在《FRONT GENET》（IF:4.599）雜志上。

1.背景：

5-甲基胞嘧啶 (5mC) 和 5-羥甲基胞嘧啶 (5hmC) 都是神經發育中重要的表觀遺傳修飾。然而很少有研究在自然高海拔條件下鑒定動物大腦區域的全基因組5mC和5hmC模式。

2.材料和方法：

從Riwoqe耗牛和三江牛（牛）中各選取三只54個月大的母牛，所選取的母牛在過去三代中沒有直接或間接的血緣關系，在當地私人農場以同樣的飲食喂養，耗牛和牛的平均活重為188.3公斤和163.0公斤。在餓一天后進行人道處死，解剖后迅速分離大腦、腦干、小腦和下丘腦，從中各收集1 cm³樣本在液氮中快速冷凍并在-80°C下儲存直至RNA和DNA提取。

利用RRBS+oxRRBS技術鑒定牦牛和牛的大腦、腦干、小腦、下丘腦的基因組5mC和5hmC位點，繪制全基因組DNA甲基化和羥甲基化圖譜，并進行DNA甲基化/羥甲基化差異化分析和對應轉錄組的關聯分析。

3.結果：

① RRBS+oxRRBS繪制牦牛和牛的大腦、腦干、小腦和下丘腦DNA甲基化和羥甲基化圖譜

RRBS+oxRRBS測序單堿基水平檢測牦牛和牛的大腦、腦干、小腦和下丘腦DNA甲基化和羥甲基化水平，平均CpG位點為3.28M，平均深度大于10X。

FIGURE 1：Global DNA methylation and hydroxymethylation among the samples.

（A） RRBS和oxRRBS文庫中正鏈和負鏈修飾位點差異的Violin圖

（B） Fisher精確檢驗計算RRBS和oxRRBS文庫中羥甲基化水平和p值的Volcano圖

（C） 牦牛編碼基因中的甲基化和羥甲基化分布

（D） 牛編碼基因中的甲基化和羥甲基化分布

② 牦牛和牛的下丘腦和其他大腦區域5mC和5hmC差異化分析

作者在牦牛和牛大腦區域的每次成對比較中確定差異甲基化區域（DMRs）和差異羥甲基化區域（DhMRs）。在耗牛和牛的下丘腦中發現大部分的DMRs和DhMRs，差異主要在于5mC水平下降和5hmC水平升高。作者進一步發現大多數DhMRs（牦牛72.9%，牛75.7%）與DMR相對應，表明5mC和5hmC水平在同一位點“升降”。耗牛樣本的大腦、腦干、小腦和下丘腦組織RRBS文庫的基因DNA修飾水平沒有明顯差異，而在牛樣本這些組織中發現顯著差異。因此，作者推測5mC和5hmC水平的“升降”可能是特定組織或生物過程中的一種調節機制，并證實了在未來研究中同時研究5mC和5hmC水平的必要性。

FIGURE 2：Identification of DMRs and DhMRs in yak and cattle.

（A）牦牛（上）和牛（下）兩種組織樣本中DMR（藍）和DhMRs（黃）的數量比較。

（B）牦牛和牛樣本各組織RRBS文庫中總甲基化和羥甲基化分布。

（C）對牦牛DMRs平均甲基化水平的無監督聚類分析顯示DMRs與神經系統相關的GO terms的基因富集相關聯。

（D）對牦牛DhMRs平均羥甲基化水平的無監督聚類分析顯示DhMRs與神經系統相關的GO terms基因富集相關聯。

（E）對牦牛DhMRs相關基因mRNA水平的無監督聚類分析，顯示與神經系統相關的GO terms基因富集相關聯。

③ 轉錄組關聯分析發現牦牛和牛的下丘腦具有特異性基因表達模式

作者對相應的轉錄組進行關聯分析，轉錄組測序共獲得22477個轉錄本，這些轉錄本被注釋到GO、KEGG、TrEMBL數據庫。與其他大腦組織相比，大多數差異表達基因(Differentially Expressed Gene,DEG)在下丘腦中發現，其中64.9%的DEGs在下丘腦中下調。這一結果進一步表明，5mC和5hmC水平的“升降”主要發生在CDS和內含子區域，可能對基因表達起調控作用。

FIGURE 3：Identification of DEGs in yak and cattle.

（A）牦牛（藍色）和牛（黃色）各樣本組織DEGs數量比較，“NA”表示未比較。

（B）牦牛下丘腦和大腦之間DEGs的GO terms和KEGG通路富集。

（C）牛下丘腦和腦干之間DEGs的GO terms和KEGG通路富集。

④ 牦牛下丘腦中5mC或5hmC調控的差異表達基因在神經調節和髓鞘形成中發揮作用

作者鑒定出652個可能受DMR或DhMR調控的基因，在這些基因中，上調基因的平均甲基化水平低于下丘腦下調基因，上調和下調的基因組在大腦、腦干和小腦中均顯示出相似的基因表達水平。表明下丘腦中顯示出不同的基因表達、DNA甲基化和羥甲基化譜。

在前五個上調基因中，PTGDS基因在下丘腦中高度轉錄，可能受啟動子的hypoDMR調控。在前五個下調基因中，髓鞘堿性蛋白（MBP）在大腦、腦干和小腦中富集，且可能在下丘腦中受啟動子和基因的hyperDMR調控。

FIGURE 4：DEGs associated with DMRs or DhMRs in yak.

（A）與其他腦組織相比，牦牛下丘腦與DMR/DhMR相關的DEGs平均甲基化和羥甲基化水平，將DEGs分成上調組和下調組。

（B）與其他腦組織相比，牦牛下丘腦中上調基因組的mRNA水平的無監督聚類。

（C）與其他腦組織相比，牦牛下丘腦中下調基因組的mRNA水平的無監督聚類。

（D）（左）耗牛最上調基因PTGDS側翼3000bp的甲基化水平，（右）其中一個DMR區域的甲基化水平。

（E）（左）耗牛最下調基因MBP側翼3000bp的甲基化水平，（右）其中一個DMR區域的甲基化水平。

在牛樣本中，作者鑒定574個可能受DMR或DhMR調控的基因，只有16.03%在下丘腦和其他大腦區域存在差異表達。此外，與其他組織相比，牦牛下丘腦中前五個下調基因在牛下丘腦中也顯示下調，而牦牛下丘腦中前五個上調基因中只有一個在牛下丘腦中顯示上調。與髓鞘形成相關的下調基因MBP的mRNA水平可以通過牛下丘腦基因組高甲基化來調控。

FIGURE 5：DEGs associated with DMRs or DhMRs in cattle.

（A）牦牛和牛DMRs/DhMRs相關上調DEGs和下調DEGs的重疊。

（B）與其他大腦區域相比，牦牛和牛下丘腦中前五個上調基因和下調基因的mRNA水平熱圖。

（C）（左）牛的最下調基因MBP側翼3000bp的甲基化水平，（右）其中一個DMR區域的甲基化水平。

小結

本研究利用RRBS+oxRRBS技術發現牦牛和牛的下丘腦和其他大腦區域的5mC和5hmC存在顯著差異，鑒定出差異甲基化區域（DMR）和差異羥甲基化區域（DhMR），其中大多數彼此重疊。最后，驗證了DMRs和DhMRs調控的差異表達基因（DEGs）可能在神經調節和髓鞘形成中發揮重要作用。總之結果表明，5mC和5hmC介導的表觀遺傳調控可能廣泛影響下丘腦的發育及其生物學功能，有助于提高高海拔條件的生理適應性。

本研究利用的RRBS+oxRRBS是易基因的成熟優勢DNA修飾測序技術，該技術通過化學氧化結合重亞硫酸鹽處理首先將5hmC氧化為5fC，進而可被重亞硫酸鹽轉換成U，從而排除了5hmC對5mC的信號干擾，達到精確檢測基因組5mC的目的，具有實驗數據優質、多組學分析數據精準等優勢。

參考文獻：

doi.org/10.3389/fgene.2021.592135