神經(jīng)精神病學(xué)研究中的重大挑戰(zhàn)之一便是開(kāi)發(fā)能準(zhǔn)確反映與情感障礙相關(guān)的癥狀的動(dòng)物模型。慢性社交挫敗應(yīng)激模型已被證明是研究抑郁癥的有效模型。在該模型中，C57BL/6J小鼠連續(xù)10天遭受CD-1小鼠攻擊，誘導(dǎo)其產(chǎn)生慢性社交挫敗應(yīng)激。本文描述了CD-1攻擊小鼠的篩選過(guò)程，C57BL/6J和CD-1攻擊小鼠之間的社交互動(dòng)，以及作為抑郁樣行為指標(biāo)的社會(huì)回避評(píng)分的分析。

關(guān)鍵詞：社交挫敗，抑郁，慢性應(yīng)激，社會(huì)互動(dòng)，小鼠模型

 研究背景

抑郁癥是一種反復(fù)發(fā)作且危及生命的疾病，影響著全球約1.2億人。在神經(jīng)精神病學(xué)研究領(lǐng)域中，開(kāi)發(fā)有效的抑郁癥動(dòng)物模型至關(guān)重要，有效的動(dòng)物模型可幫助人類理解抑郁癥背后的神經(jīng)和分子機(jī)制。目前，用于誘發(fā)小鼠的抑郁癥的各種慢性應(yīng)激包括：慢性不可預(yù)測(cè)應(yīng)激，足部電刺激應(yīng)激，束縛應(yīng)激等，隨后可測(cè)量其快感缺失或絕望行為（如蔗糖偏愛(ài)測(cè)試，強(qiáng)迫游泳測(cè)試和懸尾測(cè)試），但這些慢性應(yīng)激誘發(fā)的抑郁效果都不夠理想。與此同時(shí)，慢性社交挫敗應(yīng)激由于其可靠性和可重復(fù)性，已被廣泛接受為抑郁癥的有效模型。社交挫敗范式已被證實(shí)為一種很好的抑郁模型，原因如下：1)易感小鼠的抑郁表型（社交回避、快感缺失、代謝變化等）可通過(guò)慢性抗抑郁藥物的治療而逆轉(zhuǎn)，但急性給藥對(duì)其沒(méi)有效果。2)社交挫敗應(yīng)激產(chǎn)生易感表型和抗性表型可以用來(lái)解釋抑郁癥病理生理學(xué)中人類應(yīng)激易感性的個(gè)體差異。3)由社交挫敗應(yīng)激引起的易感表型是長(zhǎng)期存在的，并伴隨著大腦獎(jiǎng)賞回路的遺傳和表觀遺傳變化。

 材料和試劑

1、C57BL/6J小鼠（購(gòu)自Jeckson實(shí)驗(yàn)室）：使用7-8周齡小鼠進(jìn)行社交挫敗造模（6-7周齡小鼠需要進(jìn)行一周的環(huán)境適應(yīng)期）

注：小鼠置于標(biāo)準(zhǔn)籠里，每個(gè)籠子限4-5只小鼠。

2、CD-1小鼠（(Charles River實(shí)驗(yàn)室）：將4-6個(gè)月大的雄性非繁殖鼠單獨(dú)飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)鼠籠內(nèi)。

注：社交挫敗范式使用受試小鼠的統(tǒng)一從屬關(guān)系作為社交應(yīng)激源，在本方案中采用了最常見(jiàn)的C57BL/6J：CD-1從屬關(guān)系。

清潔試劑（用于清潔場(chǎng)地和作為社交互動(dòng)場(chǎng)地/分隔器的樹(shù)脂玻璃）：0.5%過(guò)氧化氫。

設(shè)備

1.透明鼠籠（帶墊料的一次性鼠籠）（Innovive，目錄編號(hào)：RS1-H-C8)

2.標(biāo)準(zhǔn)水瓶（小鼠水瓶）（Innovive，目錄編號(hào)：M-WB-300)

3.帶吸管的水瓶塞（氯丁橡膠塞）（Ancare，目錄編號(hào)：OT-199-3”）

4.圓筒支架（定制的塑料支架，可作為額外的水口；圖2B)

5.分隔器（定制的透明穿孔樹(shù)脂玻璃板；圖2B)

6.可拆卸外殼（定制的透明有機(jī)玻璃，頂部和底部均打開(kāi)；圖3B)

7.秒表

8.露天試驗(yàn)室（定制，44（寬）x 44（長(zhǎng)） x 30（高）；厘米）

9.社交互動(dòng)測(cè)試視頻跟蹤系統(tǒng)（如VisuTrack動(dòng)物行為分析軟件，CCD攝像機(jī)及計(jì)算機(jī)）

實(shí)驗(yàn)流程

1、CD-1攻擊性小鼠的篩選 

a.訂購(gòu)4-6個(gè)月大的雄性CD-1小鼠（至少多訂購(gòu)2-3倍，因?yàn)橹挥胁坏揭话氲腃D-1小鼠具有足夠的攻擊性）。CD-1小鼠單獨(dú)安置在標(biāo)準(zhǔn)鼠籠里，給予足夠的食物和水。并使CD-1小鼠在開(kāi)始篩選過(guò)程前適應(yīng)它們的新環(huán)境一周。

b.僅用于篩選CD-1小鼠的C57BL/6J雄性“篩選鼠”。“篩選鼠”的年齡范圍在8-20周，并可用于后續(xù)的篩選過(guò)程。在此過(guò)程中需要排除具有攻擊性的“篩選鼠”。

c.CD-1小鼠的篩選是在CD-1小鼠的籠子中進(jìn)行的。C57BL/6J“篩選鼠”直接放入CD-1小鼠籠中5 min。記錄每只CD-1小鼠的攻擊潛伏期，連續(xù)3天，每天一次，進(jìn)行三次篩選。

d.CD-1攻擊小鼠的篩選標(biāo)準(zhǔn)：在三次篩選過(guò)程中，CD-1攻擊小鼠連續(xù)兩個(gè)階段初始攻擊潛伏期必須小于60秒，且必須連續(xù)攻擊C57BL/6J “篩選鼠”至少10秒。

e.CD-1攻擊小鼠在初始篩選后可使用3個(gè)月（CD-1攻擊性小鼠可能習(xí)慣社交挫敗過(guò)程，因此需要在下一次社交挫敗實(shí)驗(yàn)之前重新篩選）。

2、慢性社交挫敗應(yīng)激（圖1）

圖1|社交挫敗應(yīng)激造模和社交互動(dòng)測(cè)試的示意圖（慢性社交挫敗造模方案使用CD-1攻擊性小鼠執(zhí)行了連續(xù)10天的社交挫敗，然后進(jìn)行社交互動(dòng)測(cè)試和后續(xù)分析）

a.組裝社交挫敗籠（圖2A)，取標(biāo)準(zhǔn)鼠籠，籠底部填充木片墊料。將穿孔的有機(jī)玻璃分隔板放置在籠子的中心。社交挫敗鼠被隔離出來(lái)，并允許其在非社交挫敗區(qū)域內(nèi)進(jìn)行感官互動(dòng)。放置圓柱體（附加的水瓶架）在標(biāo)準(zhǔn)水瓶的對(duì)面。用圓筒支架插入組裝好的水瓶。確保鼠能飲用到水。將食物放在兩側(cè)的底部（水和食物應(yīng)隨意供應(yīng)）。將標(biāo)準(zhǔn)鼠籠蓋牢固地放在鼠籠上。為期10天的社交挫敗方案至少需要10個(gè)帶有CD-1攻擊鼠的社交挫敗籠。

注意：分隔器應(yīng)裝配牢固，防止小鼠逃逸。

圖2|慢性社交挫敗應(yīng)激的標(biāo)準(zhǔn)籠（A.用于慢性社交挫敗應(yīng)激造模的標(biāo)準(zhǔn)鼠籠：CD-1攻擊小鼠被永-久安置在穿孔分隔器的一側(cè)，而C57BL/6J小鼠每天在兩側(cè)交換位置，以防止對(duì)攻擊的習(xí)慣化。B. 標(biāo)準(zhǔn)鼠籠的附加部件尺寸（定制）：在標(biāo)準(zhǔn)水瓶側(cè)的對(duì)面的圓筒支架裝有一個(gè)額外的水瓶。在非社交挫敗環(huán)節(jié)期間，穿孔的有機(jī)玻璃分隔器隔離兩種老鼠（允許感官互動(dòng)））。

b.在社交挫敗環(huán)節(jié)開(kāi)始前一晚，將CD-1攻擊鼠放置在已被分隔的鼠籠的一側(cè)，使其適應(yīng)新環(huán)境。

注：首-選圓筒支架側(cè)。

c.在社交挫敗環(huán)節(jié)的第一天，將C57BL/6J小鼠直接放入CD-1攻擊小鼠同一側(cè)。在5-10 min的社交挫敗后（視頻源如下），將C57BL/6J鼠轉(zhuǎn)移到穿孔隔板的對(duì)側(cè)，持續(xù)24小時(shí)。

注意：在社交挫敗環(huán)節(jié)開(kāi)始時(shí)，將C57BL/6J鼠放在靠近CD-1攻擊鼠附近有助于啟動(dòng)其攻擊性行為。可同時(shí)對(duì)10只受試小鼠進(jìn)行社交挫敗應(yīng)激。

d.對(duì)照組應(yīng)將C57BL/6J小鼠放置在一個(gè)相同的社交挫敗籠中，在穿孔有機(jī)玻璃分隔器的兩側(cè)各設(shè)置一只小鼠（將CD-1小鼠替換為C57BL/6J小鼠），持續(xù)10天，禁止任何身體接觸。這些小鼠同樣在隔板兩側(cè)轉(zhuǎn)換。

e.每只受試的C57BL/6J小鼠將每天面臨1只不同的CD-1小鼠，連續(xù)重復(fù)上述社交挫敗操作10天。

f.在最后一次社交挫敗之后，單獨(dú)飼養(yǎng)所有C57BL/6J小鼠。所有的CD-1攻擊性小鼠也都送回它們單獨(dú)飼養(yǎng)的籠子里，用于未來(lái)的社交挫敗實(shí)驗(yàn)（未來(lái)需要根據(jù)其攻擊性重新篩選）。

3、社交互動(dòng)測(cè)試

a.社交互動(dòng)測(cè)試在最后一次社交挫敗后24小時(shí)進(jìn)行。在社交互動(dòng)測(cè)試中，CD-1攻擊小鼠對(duì)于被測(cè)試的C57BL/6J小鼠應(yīng)該是完-全陌生的。在進(jìn)行社交互動(dòng)測(cè)試前，篩選CD-1攻擊性小鼠，以確保小鼠符合攻擊性標(biāo)準(zhǔn)。

b.社交互動(dòng)場(chǎng)地如圖3所示。配置視頻跟蹤系統(tǒng)（如VisuTrack軟件），通過(guò)跟蹤軟件自動(dòng)收集所有數(shù)據(jù)。

圖3|社交互動(dòng)測(cè)試場(chǎng)地的示意圖（A.社會(huì)互動(dòng)分析的區(qū)域劃分。B. 可拆卸的穿孔有機(jī)玻璃外殼，外殼內(nèi)部放入CD-1小鼠）

c.在與外部噪聲源和動(dòng)物隔離及紅光條件下，于社交互動(dòng)測(cè)試前先讓受試鼠適應(yīng)環(huán)境1小時(shí)。

d.在紅光條件下，每個(gè)社交互動(dòng)測(cè)試都由兩個(gè)2.5 min的階段組成。在第一階段，將社交挫敗模型小鼠放入社交互動(dòng)區(qū)域（在有機(jī)玻璃外殼對(duì)面的中心），并允許其在沒(méi)有CD-1小鼠的情況下自由探索。

注意：在第一階段比賽結(jié)束后，不要清理實(shí)驗(yàn)場(chǎng)地。

e.在第一階段結(jié)束后，將模型鼠取回，直到第二階段。然后，將CD-1鼠標(biāo)直接放入有機(jī)玻璃外殼內(nèi)。

注意：將CD-1鼠從外殼頂部輕輕放下。

f.在第二階段，重新放入模型鼠，并讓它在CD-1小鼠存在的情況下自由移動(dòng)。

注意：在兩個(gè)階段之間以相同的方式放置模型鼠。

g.在每次測(cè)試結(jié)束時(shí)。使用清潔液清洗所有設(shè)備。

h.數(shù)據(jù)可以按照數(shù)據(jù)分析部分中的描述進(jìn)行分析。

 數(shù)據(jù)分析 

使用自動(dòng)視頻跟蹤系統(tǒng)，可以從每個(gè)試驗(yàn)的視頻數(shù)據(jù)中計(jì)算出交互區(qū)和角落區(qū)的停留時(shí)間。在本研究中，對(duì)照組小鼠通常在互動(dòng)區(qū)花費(fèi)的時(shí)間更多，而模型鼠的社交互動(dòng)時(shí)間顯著減少（圖4）。因此，小鼠的社交能力可以通過(guò)比較在CD-1鼠的互動(dòng)區(qū)域內(nèi)的停留時(shí)間來(lái)量化。社交互動(dòng)比（SI ratio）計(jì)算方法如下：

注：Interaction zone time of "target" trial——CD-1攻擊鼠存在情況下，受試鼠在互動(dòng)區(qū)域內(nèi)停留時(shí)間；

Interaction zone time of "no target" trial——CD-1攻擊鼠不存在的情況下，受試鼠在互動(dòng)區(qū)域內(nèi)停留時(shí)間。

SI比值低于100%的小鼠被歸為抑郁易感小鼠，另一方面，SI比值超過(guò)100%的小鼠屬于抑郁抗性組。在大多數(shù)情況下，超過(guò)一半的C57BL/6J小鼠在受到慢性社交挫敗應(yīng)激時(shí)表現(xiàn)出易感表型。角落區(qū)停留時(shí)間是社交回避的另一個(gè)有用指標(biāo)，它往往與互動(dòng)區(qū)停留時(shí)間呈負(fù)相關(guān)（圖4B）。

圖4|社交互動(dòng)測(cè)試的統(tǒng)計(jì)分析

  注意事項(xiàng)

1、針對(duì)社交挫敗應(yīng)激籠的設(shè)置可以有所不同，還可以根據(jù)籠的形狀和尺寸對(duì)分隔器、圓筒等附加設(shè)備進(jìn)行修改或替換。

2、社會(huì)挫敗持續(xù)時(shí)間（5-10 min）可以根據(jù)CD-1攻擊性小鼠的攻擊性來(lái)調(diào)整，以應(yīng)對(duì)適當(dāng)?shù)纳眢w壓力，避免造成嚴(yán)重傷害。仔細(xì)觀察每一個(gè)過(guò)程，替換那些攻擊性太強(qiáng)（持續(xù)留下開(kāi)放性傷口）或在社交挫敗過(guò)程中攻擊性不夠的CD-1小鼠。對(duì)嚴(yán)重受傷的社交挫敗鼠實(shí)施安-樂(lè)-死。

3、社會(huì)挫敗方案的變化：為了縮短應(yīng)激周期（例如與病毒表達(dá)周期相一致，如HSV）或減少對(duì)植入套管的損傷（例如光遺傳學(xué)），可以適當(dāng)縮短社會(huì)挫敗應(yīng)激范式的造模時(shí)間。

a.單次最大社交挫敗應(yīng)激方案（1天）：將小鼠放入CD-1鼠的籠子中5分鐘，然后休息15分鐘；用新的CD-1鼠重復(fù)上述步驟至少兩次。

b.短期社交挫敗應(yīng)激方案（4~5天）：造模小鼠每天經(jīng)歷兩次社交挫敗，持續(xù)4~5天。