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反相色譜仍然是色譜工作者“武器庫”中最有價值的工具之一。這是一種廣為人知的技術，依賴于分析物和固定相之間的疏水相互作用。對于完整蛋白質，該技術使用有機溶劑梯度作為流動相，通常使用離子對試劑。在這些條件下，分子很可能發生變性。這是一種靈敏的分析技術，因為樣品保留在色譜柱上得到濃縮，且適用于質譜分析。因此，該技術適用于測定完整蛋白質的精確質量。
對于大分子蛋白質（例如單克隆抗體），甚至對于較小的片段（例如重鏈和輕鏈或 IgG 分子的 Fab 和 Fc 區域），推薦使用大孔徑色譜柱。安捷倫能夠提供多種配置的 300 ? 和 450 ? 產品，包括全多孔、采用表面多孔顆粒的 Poroshell 技術以及一系列烷基鍵合相。鍵合相通常具有較短的碳鏈長度（C8 或 C4/C3）或具有更多獨特的配體，例如可提供不同選擇性的二苯基。由于反相色譜分析準確度高，因此可以使用完整蛋白質和片段分析來比較生物治療藥物的生物仿制藥與原研藥。然而，始終需要執行額外的測試以鑒定可能檢出的不同異構體的具體位置。
色譜柱選擇
選擇用于完整蛋白質分析的反相色譜柱時需要考慮多個相互關聯的因素：樣品分子量和最適合的填料孔徑，色譜柱固定相，所用的儀器（特別是檢測器的類型），流動相條件，以及速度或通量要求等。
分析物分子越大，則需要越大的孔徑。除一些例外情況，用于完整蛋白質分析的孔徑通常為 300–500 ?。根據經驗，孔徑至少應為蛋白質流體動力學半徑的三倍。AdvanceBio RP-mAb 色譜柱具有 450 ? 的孔徑，ZORBAX RRHD 300 ?、ZORBAX 300SB 和 Poroshell 300 均具有 300 ? 的孔徑，而 PLRP-S 提供多種孔徑。雖然 1000 ? 的 5 µm PLRP-S 色譜柱孔徑明顯大于常用于完整蛋白質分析的色譜柱，但是該色譜柱可為完整蛋白質和蛋白質片段分析提供優異的結果。
對于反相色譜柱，選擇色譜柱固定相的通用指南是，分子量越大，使用的烷基鏈應越短。因此，C18 色譜柱常用于多肽分析，而 C8、C4 和 C3 色譜柱常用于完整蛋白質分離。除線性烷基鏈以外，AdvanceBio RP-mAb、ZORBAX RRHD 300 和 ZORBAX 300SB 色譜柱可提供二苯基固定相。有時，二苯基固定相的不同選擇性可提供所需的分離。PLRP-S 是一種聚合物填料而不是硅膠基填料。它提供典型的反相分離以及略有不同的選擇性和寬 pH 耐受性。
此外，本篇應用文集中還包含 AdvanceBio RP mAb、PLRP-S、AdvanceBio HIC、ZORBAX RRHD 300SB 等應用簡報供您查閱，為生物治療藥物關鍵質量屬性提供新方法，新思路。
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