色譜柱是高效液相色譜儀最主要的部件，被測物質(zhì)能否被很好的分離和測定，色譜柱的性能起著決定性的作用，因此，應特別注意色譜柱的活化環(huán)節(jié)，此外色譜柱的日常維護也很重要，有效地維護可以延長色譜柱的使用壽命。

液相色譜的柱子通常分為正相柱和反相柱。正相柱大多以硅膠為柱，或是在硅膠表面鍵合-CN,-NH3等官能團的鍵合相硅膠柱;反相柱填料主要以硅膠為基質(zhì)，在其表面鍵合非極性的十八烷基官能團(ODS)稱為C18柱，其它常用的反相柱還有C8,C4,C2和苯基柱等。另外還有離子交換柱，GPC柱，聚合物填料柱等。

色譜柱的活化

新的液相色譜柱都是保存在一定的保存液中的，所謂的活化就是替換掉其中的保存液，沖洗掉柱中可能殘留的其他雜質(zhì)，以免影響后續(xù)分析工作。液相色譜柱的活化方法因柱子而異。

反相色譜柱：使用新的C18柱時，先用甲醇或乙-腈沖洗20-30個柱體積，然后用甲醇/乙-腈：水(50:50)沖洗10個柱體積，然后再用流動相平衡10-30柱體積。

正相色譜柱：新柱用流動相平衡20-30個柱體積。

離子色譜柱(SAX, SCX)：新柱先用100%甲醇或乙-腈沖洗20個柱體積，然后轉(zhuǎn)換到流動相平衡。

不同的色譜柱活化的方法不盡相同，要根據(jù)柱子的種類來選擇活化方法。另外，要提醒的是，柱子活化時不要接檢測器，避免不必要的污染。

液相色譜柱的維護

色譜柱的維護有一定的程序：色譜柱的平衡、色譜柱的再生、最后才是色譜柱的維護。

1、色譜柱的平衡

反相色譜柱由工廠測試后是保存在乙腈/水中的。新柱應先使用10-20倍柱體積的甲醇或乙腈沖洗色譜柱。請一定確保您分析樣品所使用的流動相和乙腈/水互溶。每天用足夠的時間以流動相來平衡色譜柱，您就會在處理問題方面獲得最大的"補償"，而且您的色譜柱的壽命也會變得更長!

操作步驟：

a. 平衡開始時將流速緩慢地提高，用流動相平衡色譜柱直到獲得穩(wěn)定的基線(緩沖鹽或離子對試劑流速如果較低，則需要較長的時間來平衡)

b. 如果使用的流動相中含有緩沖鹽，應注意用純水"過渡"即每天分析開始前必須先用純水沖洗30分鐘以上再用緩沖鹽流動相平衡; 分析結(jié)束后必須先用純水沖洗30分鐘以上除去緩沖鹽之后再用甲醇沖洗30分鐘保護柱子。

2、色譜柱的再生

長期使用的色譜柱，往往柱效會下降(柱子的理論塔板數(shù)減低)。可以對色譜柱進行再生，在有條件的實驗室應使用一個廉價的泵進行柱子的再生。

選擇再生方法：

極性固定相(如Si，NH2* ，DIOL基色譜填料)的再生：正庚烷→氯仿→乙酸乙酯→丙酮→乙醇→水。非極性固定相(如反相色譜填料RP-18，RP-8，CN等)的再生：水→乙腈→氯仿(或異丙醇)→乙腈→水。

注意：

a. 在對NH2改性的色譜柱進行再生時，由于NH2可能以銨根離子的形式存在，因此應該在水洗后用0.1M的氨水沖洗，然后再用水沖洗至堿溶液*流出。

b. 0.05M稀硫酸可以用來清洗已污染的色譜柱，如果簡單的用有機溶劑/水的處理不能夠*洗去硅膠表面吸附的雜質(zhì)，在水洗后加用0.05M稀硫酸沖洗非常有效。

3、色譜柱的維護

a.使用預柱保護分析柱(硅膠在極性流動相/離子性流動相中有一定的溶解度);

b.大多數(shù)反相色譜柱的pH穩(wěn)定范圍是2-7.5，盡量不超過該色譜柱的pH范圍;

c.避免流動相組成及極性的劇烈變化;

d.流動相使用前必須經(jīng)脫氣和過濾處理;

e.如果使用極性或離子性的緩沖溶液作流動相，應在實驗完畢柱子沖洗干凈，并保存于甲醇或乙腈中;

f.氯化物的溶劑對其有一定的腐蝕性，故使用時要注意，柱及連接管內(nèi)不能長時間存留此類溶劑，以避免腐蝕。

液相色譜柱的使用注意事項

液相色譜柱的儲存液無特殊說明，均為評價報告所示的流動相。在使用前，一定要注意液相色譜柱的儲存液與要分析樣品的流動相是否互溶。在反相色譜中，如用高濃度的鹽或緩沖液作洗脫劑，應先用10%左右的低濃度的有機相洗脫劑過渡一下，否則緩沖液中的鹽在高濃度的有機相中很容易析出，堵塞色譜柱。

1、流動相

流動相中所使用的各種有機溶劑要盡可能使用色譜純，配流動相的水最好是超純水或全玻璃器皿的雙蒸水。如果將所配得流動相再經(jīng)過0.45μm 的濾膜過濾一次則更好，尤其是含鹽的流動相。另外，裝流動相的容器和色譜系統(tǒng)中的在線過濾器等裝置應該定期清洗或更換。

但如果您實驗室中同時有液質(zhì)與液相的話，建議液質(zhì)的流動相不要輕易過膜，容易出現(xiàn)交叉污染，或者液質(zhì)使用專門的過膜儀器。

液相與液質(zhì)混用過膜裝置，導致三乙胺進入質(zhì)譜，響應突然下降。

以常規(guī)硅膠為基質(zhì)的鍵合相填料通常的pH值適用范圍是2.0-8.0。當必須要在pH值適用范圍的邊界條件下使用色譜柱時，每次使用結(jié)束后立即用適合于色譜柱儲存并與所使用的流動相互溶的溶劑清洗，并*置換掉原來所使用的流動相。

不同填料的色譜柱，PH、柱溫的范圍是不一樣的。

2、樣品

樣品也要盡可能清潔，可選用樣品過濾器或樣品預處理柱(spe)對樣品進行預處理;若樣品不便處理，要使用保護柱。在用正相色譜法分析樣品時，所有的溶劑和樣品應嚴格脫水。

一般樣品高速離心就可以了，但需注意取上清時，不要取到下面的沉淀物質(zhì)以及色譜柱前最好加裝 預柱或在線過濾器。

3、反相液相色譜柱色譜柱每天實驗后的保養(yǎng)

使用緩沖液或含鹽的流動相，實驗完成后應用10%的甲醇/水沖洗30分鐘，洗掉色譜柱中的鹽，再用甲醇沖洗30分鐘。注意：不能用純水沖洗柱子，應該在水中加入10%的甲醇，防止將填料沖塌陷。

4、長期保存色譜柱

如色譜柱要長時間保存，必須存于合適的溶劑下。對于反相柱可以儲存于純甲醇或乙腈中，正相柱可以儲存于嚴格脫水后的純正己烷中，離子交換柱可以儲存于水(含防腐劑或柳硫汞)中，并將購買新色譜柱時附送的堵頭堵上。儲存的溫度最好是室溫。

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