● 樣品準備：人 K562 細胞裂解物的酶解產物，來自SWATH Acquisition performance kit (SCIEX)。進樣量范圍為 12.5 ng - 400 ng。

● 液相方法： ACQUITY UPLC  M-Class液相系統（Waters），分析色譜柱：Phenomenex Kinetex XB-C18 (2.6 μm, 100 Å, 150 x 0.3 mm)，Trap柱：Phenomenex micro trap (5 μm, 100 Å, 10 x 0.3 mm)，流速：5 μL/min，液相梯度：10 min, 45 min。

● 質譜方法：ZenoTOF 7600系統2臺，兩種采集流程：Zeno DDA、可變窗口Zeno SWATH DIA，樣品平行采集三次。

● 數據處理： Zeno DDA數據用OneOmics^™軟件包中ProteinPilot^™應用程序，使用人類理論數據庫進行搜庫。Zeno SWATH DIA數據使用DIA-NN^[1]軟件處理。

在12.5ng - 400 ng進樣量范圍內，在相同進樣量條件下，Zeno SWATH DIA鑒定的蛋白質數量約為Zeno DDA的 2 倍， 2 臺 ZenoTOF^™ 7600 系統測試結果一致。進一步進行蛋白質種類比較，Zeno SWATH DIA鑒定的蛋白質幾乎覆蓋了Zeno DDA 鑒定到的蛋白質。

相比于通過MS1數據進行定量的Zeno DDA策略來說，Zeno SWATH DIA策略可產生豐富的MS/MS數據，因此可獲得更可靠、更明確的定量數據。使用 Zeno SWATH DIA 工作流程時，無論使用譜圖庫還是Library-free的數據處理策略，定量CV < 20%的蛋白質均占總鑒定蛋白質約90% 。三種不同數據處理方法的鑒定蛋白質數量相似，該結果顯示了Library-free處理方法的能力。

隨后比較Library-free處理生成的結果與使用譜圖庫處理的結果，維恩圖（圖 4）顯示二者得到的蛋白質鑒定信息非常相似，進一步增加了Library-free方法的可信度。

使用快速 10 min液相梯度重復本研究，以確認 Zeno SWATH DIA 工作流程在更快的液相梯度中鑒定蛋白質數量的提升倍數。相比于 Zeno DDA 方法， 45 min液相梯度，Zeno SWATH DIA 方法蛋白質鑒定量提升約2倍（圖 5）。隨著液相梯度加快， 使用Zeno SWATH DIA可獲得更大蛋白質鑒定增益，蛋白質鑒定數量增加到 2.5倍 -3 倍。因此，當進行大樣本分析時，更適合選用Zeno SWATH DIA工作流程。

文獻：

[1] Demichev V et al. (2019) DIA-NN: neural networks and interference correction enable deep proteome coverage in high throughput. Nature Methods, 17, 41-44.

[2] Rosenberger G et al (2014) A repository of assays to quantify 10,000 human proteins by SWATH-MS. Scientific data. 1, 140031.