低分子肝素（low-molecular-weight heparin，LMWH） 是近年發(fā)展起來(lái)的新一代肝素類抗血栓藥物，其抗血栓作用優(yōu)于肝素，而抗凝血作用低于肝素，且具有皮下注射吸收良好、生物利用度高、體內(nèi)半衰期長(zhǎng)、出血傾向小等優(yōu)點(diǎn)，目前已廣泛應(yīng)用于臨床。

根據(jù)LMWH的來(lái)源、生產(chǎn)工藝、末端結(jié)構(gòu)的不同，LMWH 分為許多不同的種類，如達(dá)替肝素鈉、依諾肝素鈉、那曲肝素鈣、帕米肝素鈉、汀肝素鈉等。達(dá)替肝素鈉（Dalteparin Sodium）是低分子肝素的一種，由亞硝酸降解肝素得到，重均分子量5600～6400，峰位分子量6000，硫酸化程度為2.0～2.5/雙糖單位。

本次以達(dá)替肝素鈉為例，使用高效離子交換色譜法測(cè)定游離硫酸根含量。

樣品前處理

精密稱取達(dá)替肝素鈉20 mg，加水溶解并稀釋至10 mL，過(guò)0.22 µm濾膜。

色譜條件：

分析柱：IonPac AS11，250×4mm；

保護(hù)柱：IonPac AG11，50×4mm；

柱溫：30℃；

淋洗液：3. 0 mmol/L 碳酸鈉溶液；

流速：1.50 mL/min；

定量環(huán)：25 µL

抑制器：ASRS300 4 mm，自循環(huán)模式，電流為23 mA

檢測(cè)方式：抑制型電導(dǎo)

結(jié)果和討論

樣品濃度的選擇

達(dá)替肝素鈉為多糖，在實(shí)驗(yàn)條件下保留在色譜柱上，不能被洗脫。樣品濃度為2 mg/mL時(shí)，連續(xù)進(jìn)樣10次，硫酸根保留時(shí)間可提前0.3 min。為提高實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定性，延長(zhǎng)色譜柱使用時(shí)間，可在滿足定量限的前提下，適當(dāng)降低達(dá)替肝素鈉的濃度。

色譜柱的選擇及淋洗液梯度條件優(yōu)化

樣品中盡含有氯離子和硫酸根離子，非常易于分離。本實(shí)驗(yàn)選用IonPac AS11色譜柱、3.0 mmol/L碳酸鈉溶液作為淋洗液，操作簡(jiǎn)單。、

重現(xiàn)性、線性和靈敏度

取達(dá)替肝素鈉樣品，平行處理六份，在選定的色譜條件下進(jìn)行分離分析，硫酸根的重現(xiàn)性較好，峰面積、保留時(shí)間、峰高的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）均低于5%。選擇一個(gè)樣品重復(fù)六次進(jìn)樣，硫酸根的保留時(shí)間、峰面積和峰高的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）均低于5%，其結(jié)果見(jiàn)下圖。

達(dá)替肝素鈉樣品中硫酸根的重現(xiàn)性結(jié)果

在選定色譜條件下配制適宜濃度范圍的離子標(biāo)準(zhǔn)曲線，硫酸根在0.1~40 mg/L范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，其線性相關(guān)系數(shù)r=0.9995。在本實(shí)驗(yàn)條件下，基線噪音約為1.0 nS，根據(jù)三倍基線噪音計(jì)算出方法對(duì)硫酸根的定量限為31.7 µg/L，折合樣品中硫酸根含量0.00015%。

實(shí)際樣品分析及加標(biāo)回收

取達(dá)替肝素鈉樣品測(cè)定并進(jìn)行加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，硫酸根的加標(biāo)回收率依次在99~102%之間。樣品檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)下圖。

實(shí)際樣品檢測(cè)結(jié)果及其加標(biāo)回收率

采用本方法可以方便、快捷、準(zhǔn)確檢測(cè)達(dá)替肝素鈉中的硫酸鹽，操作較為簡(jiǎn)單，方法重現(xiàn)性較好，結(jié)果可靠。本實(shí)驗(yàn)所使用的色譜柱同時(shí)可用于肝素鈉其它檢測(cè)項(xiàng)目如多硫酸軟骨素等項(xiàng)目的檢測(cè)。

肝素鈉中多硫酸軟骨素的鑒別及測(cè)定

色譜條件：

色譜柱AS11離子分析柱250*2mm

AG11離子保護(hù)柱50*2mm

淋洗液A：0.04%NaH2PO4， pH3.0

淋洗液B：0.04%NaH2PO4/14%NaCIO4，pH3.0

流速：0.22mL/min

進(jìn)樣體積：10uL

二元梯度：

實(shí)際樣品測(cè)定譜圖

肝素鈉產(chǎn)品中多硫酸軟骨素的測(cè)定（參照中國(guó)藥典2010及美國(guó)藥典方法）

樣品前處理：取樣品，制成20mg/mL的水溶液。

肝素鈉粗產(chǎn)品中多硫酸軟骨素的測(cè)定

樣品前處理：

取樣品0.1g,加水2.5mL,混勻溶解后加2.5mL乙腈，混勻后，于冰箱中沉降10min，取出后用10000rpm高速離心機(jī)離心10min，取上層清液4ml，用氮?dú)獯蹈珊螅盟ㄈ葜?/span>8ml，定容后的液體過(guò)0.22um尼龍濾膜，之后過(guò)OnGuard RP 柱，濾液上機(jī)分析。

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