手機版
化工儀器網手機版
化工儀器網小程序
官方微信
公眾號：chem17
掃碼關注視頻號
隨著定量蛋白質組學應用領域的不斷發展，人們正在研究更大的生物隊列，通常使用從生物樣本庫或其他來源難以獲得的珍貴樣本進行研究。這對工作流程提出了 2 個要求：更快的獲取酶解樣品的定量數據和使用更少量的樣品。數據非依賴型采集 (DIA) 作為對蛋白質組樣本中大量蛋白質進行可重復定量分析的優選工作流程，在這類研究中被廣泛應用。
本研究優化和評估了微升液相與 Zeno SWATH DIA 組合的使用，并與傳統SWATH DIA 進行比較。同時測試比較了四種不同的梯度長度（5、10、20 和 45 分鐘）的鑒定結果，以滿足一系列應用需求。
■ 樣品準備：人 K562 細胞裂解產物，來自SWATH acquisition performance kit (SCIEX)。進樣量范圍為 12.5ng - 400 ng。
■ 液相方法： ACQUITY UPLC M--Class液相系統（Waters），分析色譜柱：Phenomenex Kinetex XB-C18 (2.6 μm, 100 ?, 150 x 0.3 mm)，Trap柱：Phenomenex micro trap (5 μm, 100 ?, 10 x 0.3 mm)，流速：5 μL/min，梯度：5min, 10min, 20min, 45min（表 1）。
表1.液相梯度洗脫參數
點擊查看大圖
■ 質譜方法：ZenoTOF 7600系統2臺，采集模式：Zeno SWATH DIA，可變窗口采集，針對每個梯度長度優化使用40、60 或 80 個窗口和 MS/MS 累積時間（表 2）。在MS/MS 模式，分別開啟Zeno trap（Zeno SWATH DIA 模式）和關閉 Zeno trap（SWATH DIA模式）參數下，樣品平行采集三次。
表2. 優化的Zeno SWATH DIA方法參數
點擊查看大圖
■ 數據處理：Zeno SWATH DIA數據使用DIA-NN[1]軟件處理，使用數據庫流程，數據庫為之前由OneOmics™軟件包中ProteinPilot™軟件搜庫構建的樣本譜圖庫。
主要結果
1. Zeno SWATH DIA在低樣品量時的增益倍數評估
Zeno SWATH DIA和SWATH DIA 的進樣量曲線由DIA-NN 軟件處理得到，以確定可重復定量分析的蛋白質和肽段的數量。圖 1 顯示在 2 套 ZenoTOF™ 7600 系統上， 45 min液相梯度，每個進樣量在 SWATH DIA 和 Zeno SWATH DIA 模式得到的數據。正如預期，Zeno SWATH DIA模式下，隨著進樣量的增加，可定量蛋白質數量隨之增加。K562 400 ng 進樣量 ，在45 min液相梯度下，平均鑒定蛋白質約 6200 個，其中可定量蛋白質約 5,600 個（CV < 20%）。
點擊查看大圖
圖1. 開啟和關閉Zeno trap模式下，45 min梯度的
蛋白質定量和肽段定量的數量與進樣量的關系曲線
注：左圖為蛋白質，右圖為肽段
當固定進樣量時，相比于 SWATH DIA，Zeno SWATH DIA可定量的蛋白質和肽段數量大幅增加。在低進樣量條件下，蛋白質和肽段鑒定水平提升更高（圖 2）。
點擊查看大圖
圖2. Zeno SWATH IDA模式定量蛋白質
和肽段數量的增益倍數
注：圓形表示定量蛋白質的數量，鉆石表示定量肽段的數量
2. 快速液相梯度結果評估
通過測試 4 個 液相梯度長度。繪制進樣量曲線以評估不同的液相梯度對定量蛋白質數量的影響并確定實驗的最佳進樣量（圖 3）。結果表明，對于5 min和 10 min較短的液相梯度，最佳進樣量約 100 ng 。對于20 min和 45 min較長的梯度，最佳進樣量約200-400 ng。
點擊查看大圖
圖3. 不同液相梯度長度進樣量曲線對比
隨著微升梯度時間的縮短，鑒定和定量的蛋白質數量減少。但在相同進樣量下， 20 min梯度定量的蛋白質數量幾乎與45 min梯度一樣多。結果表明，20 min長度梯度是采集參數的最佳色譜方案（300 μm ID 分析色譜柱，5 μL/min），因其實現了峰形與肽段分離之間的平衡。對于樣本為少量的細胞酶解產物，優選分析較快的梯度，在進樣量為 12.5 ng - 50 ng時，10 min梯度可獲得合適的蛋白質覆蓋率和良好的樣品通量。
使用 20 min液相梯度的 Zeno SWATH DIA 數據，通過繪制蛋白質定量CV%分布圖展示數據集中整體定量蛋白質的方差分布（圖4）。結果顯示，進樣量越低，蛋白質定量方差越大。
點擊查看大圖
圖4. 20 min液相梯度時蛋白質定量方差分布圖
文獻：
[1] Demichev V et al. (2019) DIA-NN: neural networks and interference correction enable deep proteome coverage in high throughput. Nature Methods, 17, 41-44.
聲明：版權為 SCIEX 所有。歡迎個人轉發分享。其他任何媒體、網站如需轉載或引用本網版權所有內容須獲得授權, 轉載時須注明「來源：SCIEX」。申請授權轉載請在該文章下“寫留言”。
免責聲明
- 凡本網注明“來源：化工儀器網”的所有作品，均為浙江興旺寶明通網絡有限公司-化工儀器網合法擁有版權或有權使用的作品，未經本網授權不得轉載、摘編或利用其它方式使用上述作品。已經本網授權使用作品的，應在授權范圍內使用，并注明“來源：化工儀器網”。違反上述聲明者，本網將追究其相關法律責任。
- 本網轉載并注明自其他來源（非化工儀器網）的作品，目的在于傳遞更多信息，并不代表本網贊同其觀點和對其真實性負責，不承擔此類作品侵權行為的直接責任及連帶責任。其他媒體、網站或個人從本網轉載時，必須保留本網注明的作品第一來源，并自負版權等法律責任。
- 如涉及作品內容、版權等問題，請在作品發表之日起一周內與本網聯系，否則視為放棄相關權利。
采購中心