上期回顧
中國疾病預防控制中心營養與健康研究所、寧波大學食品與藥學院中國食品科學與技術系、島津企業管理(中國)有限公司聯合研究,成功建立并驗證了適用于血清中多種維生素D代謝物的高通量、高靈敏度SFC-MS/MS分析方法。
上期介紹了研發背景及如何建立并優化色譜條件等研究內容。
本期將介紹對已建立的SFC-MS/MS方法進行驗證 、并與LC-MS/MS法比較等研究成果。
文章出處
Journal of Chromatography B 1120 (2019) 16-23
島津Nexera UC全相系統之SFC-MS系統
本研究采用島津超臨界流體色譜儀Nexera UC、島津三重四極桿液質聯用儀LCMS-8060
● 超臨界流體與改性劑配合使用,可在更大范圍內滿足不同極性化合物的檢測需要;
● 低死體積和背壓控制單元有效降低脈動,提高靈敏度;
● 溶劑使用量少且分析時間短,是一種綠色環保、高效的分析手段。
SFC-MS/MS方法驗證
驗證項目有:拖尾因子(TF)、保留時間RSD、峰面積RSD、標準曲線線性、檢出限(LOD)和定量限(LOQ)。
表1 SFC-MS/MS的方法驗證結果
此外,還對準確度和精密度進行了評估。如表2所示,QC和NIST樣品的準確度均<5.5%。日內和日間精密度的RSD值分別在0.52-7.93%和1.35-9.04%之間,表明SFC-MS/MS性能偏差在可接受范圍內。
表2 QC和NIST樣品的準確度和精密度(日內和日間)
SFC-MS/MS法與LC-MS/MS法的比較
將驗證過的SFC-MS/MS方法與同一色譜柱內部開發的參考LC-MS/MS方法進行比較。SFC在10 min內實現分析物的基線分離,而LC系統則需要16分鐘以上才能實現等質量的分析物的相似分離度。此外,與LC-MS/MS相比,SFC-MS/MS具有更低信噪比獲得較低的LOQ。
表3 比較SFC-MS/MS和LC-MS/MS法對VD代謝物的保留時間、信噪比(S/N)、定量限(LOQ)和峰分離度(USP)的影響。
為考察SFC-MS/MS法對實際樣品分析的準確度,對46份未加標的人血清樣品進行分析,以評估該法與LC-MS/MS方法相比的潛在偏差。如圖1,SFC-MS/MS法與LC-MS/MS法回歸相關性顯著,VD2/VD3、25-OH VD2/VD3、3-epi-25-OH VD2/VD3和24,25-(OH)2 VD3分別為R2≥0.98和P≤0.001。Bland-Altman圖表明,兩種方法之間不存在濃度依賴的差異。方法間的測量值對LC-MS/MS測量值的平均差異偏差為-0.9% ~ 2.7%。
圖1. SFC-MS/MS和LC-MS/MS方法的回歸分析和Bland-Altman
結論
本研究開發并驗證了SFC-MS/MS方法作為同時測定人血清中VD代謝物的替代方法。不同VD代謝物在SFC和LC體系中洗脫能力也有差異。并且SFC有效改善等質量分析物的分離,比LC具有更短的保留時間和更高的靈敏度。與反相LC相比,超臨界CO2更環保,有機溶劑消耗更少。因此,采用SFCMS/MS方法可以在高通量的情況下對VD代謝產物進行準確、精確的分析。建立的SFC-MS/MS方法與參考的LC-MS/MS方法對人血清中VD代謝物ng/mL水平的定量一致,兩種方法之間不存在濃度依賴性差異。然而,對于痕量(pg/mL)的VD代謝物,如1,25-(OH) VD2/VD3,還需要未來開發出更高靈敏度的質譜儀來分析。
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