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技術前沿 | 如何快速穿包裝鑒別寡核苷酸初始物料?

來源:安捷倫科技(中國)有限公司   2022年05月31日 14:46  

寡核苷酸


新冠疫情中,一般采用如聚合酶鏈反應(PCR)快速檢測是否存在 SARS-CoV-2 。PCR 檢測的目標是由亞磷酰胺為主體合成的核苷酸或者短鏈 RNA/DNA 分子。 亞磷酰胺單體的排列、化學改性以及數量賦予 RNA/DNA 序列特定靶向,應用于疾病篩查、生物醫學研究和刑事等領域。在過去幾年,寡核苷酸應用與日俱增,滿足質量要求的供應鏈日趨緊張。在 cGMP 環境下,對合成寡核苷酸的初始物料,在物料接收處進行鑒別,以保持質量標準。這是在寡核苷酸生產流程中防止原料摻假或引入劣質原料的道防線。

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本文介紹安捷倫 vaya 手持拉曼用于鑒別合成寡核苷酸的商品化物質---亞磷酰胺。實驗證明,在 cGMP 環境下 Vaya 可穿透透明或不透明容器有效鑒別和區分生物制藥的原輔料。


Agilent Vaya 手持拉曼采用空間位移拉曼(SORS)技術,可以直接穿透透明和不透明的容器鑒別原輔料(如圖 1 ),還可以準確區分類似物,例如非對映異構體、位置異構體、多晶型等。


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圖 1 . Vaya 直接穿透棕色玻璃瓶鑒別寡核苷酸初始物料


Vaya 直接穿透棕色玻璃瓶測試的五種亞磷酰胺(采購于 Sigma Aldrich),測試譜圖如下:

a. DMT-dA(bz) Phosphoramidite

b. DMT-dT Phosphoramindite

c. DMT-dG(ib) Phosphoramidite

d. DMT-dA(bz)-CPG

e. DMT-2’O-Methyl-rA(bz) Phosphoramidite

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圖 2 .  5 種亞磷酰胺的拉曼譜圖

從圖 2 看出,c 和 d 的兩種亞磷酰胺在 1000-1500cm-1 范圍有明顯特征峰,容易和其他四種亞磷酰胺區分,而其他三種亞磷酰胺就很相似,對于拉曼鑒別就具有一定挑戰。Vaya 手持拉曼采用雙參數 R2 和 LMC 同時評判測試結果是 Pass 還是 Fail ,相比單一參數評判,更容易區分相似組分。更重要的是,Vaya 在建模過程中還具備添加相似組分的功能,讓其區分相似組分的能力更加強大



建模時不添加相似組分


如圖 3 是建模不添加相似組分的 5 種亞磷酰胺的交叉驗證結果。直接隔著棕色玻璃瓶分別對每一種亞磷酰胺建模(此時沒有將其他 4 種亞磷酰胺作為相似組分添加入模型),再用每一個模型分別去驗證 5 種亞磷酰胺。理想情況應該是,只有每一個模型驗證自身時,結果是 Pass ,而驗證其他四種亞磷酰胺時,結果均是 Fail 。實際結果表明,在不添加相似組分時,由于其中幾種亞磷酰胺相似度太高,Vaya 不能穩定的區分這 5 種亞磷酰胺。于是下一步就在建模中采用添加相似組分的功能。

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圖 3 . 不添加相似組分時 5 種亞磷酰胺的交叉驗證結果


建模時添加相似組分


如圖 4 是采用添加相似組分功能后 5 種亞磷酰胺的交叉驗證結果。直接隔著棕色玻璃瓶分別對每一種亞磷酰胺建模,并將其他 4 種亞磷酰胺作為相似組分添加入模型中,啟動更智能的算法,再用每一個模型分別去驗證 5 種亞磷酰胺。結果發現,每種亞磷酰胺模型只在驗證測試自身時,結果是 Pass,驗證測試其他四種物質時都顯示 Fail。說明在采用添加相似組分功能后,Vaya 可以直接隔著棕色玻璃瓶穩定鑒別區分亞磷酰胺物質


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圖 4 . 添加相似組分時 5 種亞磷酰胺的交叉驗證結果


結語

安捷倫 Vaya 手持拉曼,無需打開容器,在物料接收處,只需幾秒即可直接驗證亞磷酰胺,快速判斷其是否被裝錯。Vaya 也同樣適用于生物制藥其他原輔料的驗證。


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