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凝膠色譜柱的填料是以剛性的球形硅膠為基質，在其表面通過共價鍵化學鍵合親水團而成。色譜柱的填料具有高性能尺寸排阻色譜所需的性能，即低吸附性和良好的孔徑分布；其pH適合范圍為2.5～7.5，可以使用與水*互溶的有機溶劑，如乙腈、丙酮、甲醇或乙醇等。
商品凝膠是干燥的顆粒，通常以40～63um的使用多。凝膠使用前需要在洗脫液中充分溶漲一至數天，如在沸水浴中將濕凝膠逐漸升溫到近沸，則溶漲時間可以縮短到1～2小時。凝膠的溶漲一定要*，否則會導致色譜柱的不均勻。熱溶漲法還可以殺死凝膠中產生的細菌、脫掉凝膠中的氣泡。
由于凝膠色譜柱凝膠的分離是靠篩分作用，所以凝膠的填充要求很高，要使整個填充柱非常均勻，否則要重填。凝膠在裝柱前，可用水浮選法去除凝膠中的單體、粉末及雜質，并可用真空泵抽氣排出凝膠中的氣泡。
在玻璃或有機玻璃的凝膠空柱，在柱的兩端皆有平整的篩網或篩板。將柱垂直固定，加入少量流動相以排除柱中底端的氣泡，在加入一些流動相于柱中約1／4的高度。柱頂部連接一個漏斗，頸直徑約為柱頸的一半，然后在攪拌下、緩慢的、均勻地、連續地加入已經脫氣的凝膠懸浮液，同時打開色譜柱的毛細管出口，維持適當的流速，凝膠顆粒將逐層水平式上升，在柱中均勻地沉積，直到所需高度位置。然后拆除漏斗，用較小的濾紙片輕輕蓋住凝膠床的表面，再用大量洗脫劑將凝膠床洗滌一段時間。
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