在HPLC方法開發中，分離度達不到要求是我們常遇到且需要解決的問題。對于這個問題，已經有非常多的研究。經典的理論模型是1999年由Zhao等人提出，如下圖中的公式所示，分離度由柱效、選擇性和保留因子決定。從圖中的擬合曲線可以看出，改變選擇性是改善分離度的最容易出奇制勝的方法。

圖1 分離度及其決定因素圖

那么，什么是選擇性呢？簡單、通俗的理解是化合物在特定的色譜條件（固定相、流動相和溫度等）下，與固定相和流動相的作用總和的差異，差異越大，選擇性也就越大，對分離度的改善也越大。星譜實驗室完成了一個非常有意思的類似物的分析方法開發，可以展示選擇性的重要性，為我們方法開發工作提供啟發。待分離的三個化合物（A，B，C）的結構如2所示：

圖2 三個待分析物的結構

我們分析并用紅色標記了三個化合物的結構上基團的差異以及這些基團可能與固定相和流動相之間發生作用力，如圖3所示：

圖3 三個化合物的結構差異及差異基團的作用力

從圖3可以看出，三個化合物之間存在氫鍵，偶極-偶極和pi-pi作用的差異，因此可以基本確定判斷：

1. 當以甲醇和乙腈作為有機相時，選擇性的差異會比較明顯；

2. 由于化合物中的基團（包括R1和R2）在常用色譜柱的耐受的pH范圍內都是非電離狀態，因此無需過多考察流動相的pH；

3. 可以選擇能夠識別這些差異的色譜柱來優化分離；

4. 這些基團本身的疏水性也有差異。

因此，我們以C18柱為色譜柱選擇的起點，選用Horizon C18這款經典的色譜柱，考察甲醇和乙腈作為流動相中的強溶劑時的分離情況，結果如圖4所示：

圖4 考察乙腈和甲醇作為流動相強洗脫溶劑的圖譜

從分離結果中可以看出，在兩種溶劑中，三個化合物體現出了非常大的選擇性差異，總體在甲醇中三者的分離效果更好。我們通常可能會在此基礎上，用Horizon C18，通過調節甲醇的比例來優化方法，實現三者的分離。但是對于這三個化合物，我們進行多次甲醇比例的優化仍然無法獲得三者足夠安全的分離度，如圖5所示：

圖5 使用Horizon C18考察不同比例的甲醇的圖譜

接下來我們從色譜柱固定相的選擇性的角度來考慮選擇能夠識別這三個化合物的差異的色譜柱，我們選擇了Horizon C18/PFP（C18和PFP同時鍵合，可以提供C18的作用的同時還可以提供PFP的pi-pi作用和氫鍵作用（受體）和偶極-偶極作用）以及Horizon C18/AR (C18和Phenyl同時鍵合，可以提供C18的作用的同時還可以提供Phenyl的pi-pi作用)，選擇和Horizon C18同樣的流動相，結果如下：

圖6 考察三款選擇性互補的色譜柱的譜圖

可以看到，Horizon C18/AR相對C18，可以改善A和B的分離，而Horizon C18/PFP可以進一步改善A和B的分離，不得不驚嘆色譜柱選擇性的威力！在這個基礎上，我們實驗室很快就開發出了足夠穩健的分析方法。

圖7 Horizon C18/PFP和C18/AR所能提供的作用力匯總

全文總結

我們通過對三個有趣的化合物的HPLC分析方法開發，剖析化合物之間的基團差異以及這些差異帶來的可能的作用力的差異，通過后續的實驗，也展示了流動相（甲醇和乙腈）和色譜柱固定相的選擇性的重要性。希望可以給我們做方法開發的用戶朋友帶來啟發。