活體顯微成像（IVM）和光學相干斷層掃描（OCT）是兩種強大的光學成像工具，能夠在活體動物中，觀察亞細胞水平的動態活動。結合標記和無標記技術的，IVM和OCT在臨床前和臨床癌癥成像方面得到非常廣泛的應用，包括腫瘤的解剖學、生理學、腫瘤內細胞遷移和腫瘤的分子學動力。這些應用對闡明癌癥生物機制、研究腫瘤的復雜生理、細胞和分子行為起到了極大幫助。同時IVM和OCT技術也在不斷發展進步以適用于更多領域。如非線性光學顯微鏡技術的發展使得能用無標簽的IVM對癌癥胞外基質進行成像。新的光學設計和算法推動了無標簽的OCT技術的發展，使得OCT能夠能精確的檢測腫瘤邊緣和脈管系統。同時熒光標簽技術促使IVM可用于追蹤腫瘤干細胞、觀察腫瘤進展中腫瘤內遺傳多樣性、追蹤治療過程中各種免疫細胞的遷移。OCT造影劑提高了OCT的靈敏度，使其能夠對腫瘤及其周圍的生理、分子表達、細胞行為進行成像。此外在雙模內窺鏡中結合使用IVM和OCT，使得我們能夠對一些腔內位置進行更有效更*的癌癥篩查，如胃腸道和膀胱，本文意在闡明每種成像技術的優缺點，重點關注過去5年來IVM和OCT在活體癌癥成像領域的重要進展、關鍵技術的發展以及在基礎癌癥生物學研究和臨床腫瘤學研究中的新興應用。這些技術在解剖、生理、細胞和分子研究角度的成像應用，幫助我們極大提高了對癌癥生物學的理解，為臨床前和臨床管理提供了更多思路。   

高分辨率體內癌癥成像技術

 影像學是腫瘤臨床管理和臨床前研究*的工具。磁共振成像（magnetic resonance imaging, MRI）和超聲等臨床成像技術能夠對癌癥的位置、解剖結構及其隨時間的變化情況進行宏觀測量，但無法測量病變的細胞和分子尺度細節?；铙w顯微（intravital microscopy, IVM）和光學相干斷層掃描（optical coherency tomography, OCT）采用不同的成像機制，能達到亞細胞尺度的分辨率，促進臨床和臨床前的廣泛研究（圖1 ）。



  圖1. IVM、OCT和標準臨床成像模式間，空間分辨率與成像深度的對比示意圖。

 IVM依賴單光子或多光子熒光顯微鏡（multiphoton fluorescent microscopy, MPM）對活體組織進行掃描，可以在單個時間點進行急性觀察，也可以在幾天到幾個月內對組織位點進行長期觀察。OCT采用雙光束干涉來捕捉通過組織的光散射模式。結合先進的熒光標簽技術，IVM可用于臨床前癌癥生物學研究中，實時表征復雜的腫瘤微環境（tumor microenvironment, TME），包括跟蹤腫瘤進展、跟蹤腫瘤脈管系統生長和退化、癌細胞轉移、腫瘤干細胞的增殖、腫瘤相關免疫細胞的遷移、癌癥治療因子與癌癥和免疫細胞之間的相互作用等等。非線性光學顯微鏡的發展使得IVM不用熒光標簽就能夠觀測到腫瘤的細胞外基質。與臨床前癌癥研究中的應用相比，IVM在臨床中應用沒那么普遍，主要集中在胃腸癌內鏡評估和膀胱腫瘤的膀胱鏡評估。OCT常用來非侵襲性地表征淺表皮膚癌和腔內腫瘤的解剖結構。與IVM相比OCT的組織滲透性更好、視野更寬、成像速度更快（表1），是臨床腫瘤研究的有力工具，如可探測腫瘤邊緣作為術中手術指導。結合最近出現的造影劑，OCT技術極大擴展了其對癌癥細胞和分子的成像能力，對腫瘤相關白細胞的實時跟蹤，對過表達的癌癥生物標記分子成像等。使用IVM和OCT進行臨床前癌癥成像研究可以幫助我們更深入探究一些基本的癌癥生物學問題。如Karagiannis等利用IVM研究了化療后常駐巨噬細胞的動態變化，發現化療會增加巨噬細胞促進乳腺癌轉移擴散的速度。SoRelle等使用OCT發現金納米顆粒造影后可以繪制出多性膠質母細胞瘤的腫瘤相關巨噬細胞的遷移軌跡。臨床上結合使用IVM和OCT能夠更有效更準確的進行癌癥篩查，也能夠更好的表征腫瘤病變的形態學和分子特征。很多癌癥成像研究可以通過OCT和IVM進行，但二者在時間和空間分辨成像深度、視野、標簽和可復用性等方面各有優劣勢（表1）。

 表1. IVM和OCT的成像特點。
   活體顯微技術（intravital microscopy, IVM）

 19世紀科學家們就已經開始用明場共聚焦顯微鏡利用組織反射信號進行成像，或使用多光子熒光顯微鏡（Multiphoton fluorescent microscopy, MPM）利用二/三次諧波產生對特定的組織結構進行成像。但明場共聚焦依賴高度半透明的組織，如內耳或眼睛，多諧波產生也依賴具有強諧波發射光譜的組織結構，如膠原和細胞脂質。因此人們又結合了熒光標簽，實現了對活體細胞和分子成像。單光子熒光顯微鏡（1-photon fluorescent microscopy, 1PM）和MPM都能激發熒光基團，1PM能夠同時對不同發射光譜的熒光基團進行成像，MPM多重性不高但組織穿透性好。熒光基團也被設計成能夠在脈管系統中長時間循環、分子靶向特定的細胞表面標記、能夠穿透細胞膜并留在細胞中，或者作為報告基因被嵌入，無論遷移到哪里都不斷表達熒光蛋白。還有“智能”納米技術，能夠根據微環境條件變化來部署熒光基團和淬滅劑。但使用熒光基團需要注意激發和發射光譜，使用對應的光源和濾光片組，同時背景自發熒光也可能影響成像。熒光壽命成像顯微技術（fluorescence-lifetime imaging microscopy）通過使用不同壽命的熒光基團來區分將周圍組織，相當于一種“時間門控”增加了成像對比度，結合標準波長過濾能夠極大便利熒光基團的鑒別，方便進行腫瘤微環境的形成和動力學研究。

 IVM通常是在動物身上制作一個窗口或背部皮膚褶小室，來對表面腫瘤如皮膚腫瘤等進行成像。但仍有大部分癌癥處于組織內部，如結腸癌、肝癌、胰腺癌等，可能需要穿透高達約600μm深度。只能借助外科手術將需要成像的部位暴露出來，這需要準備好動物模型并嚴格制定好操作和成像步驟。 

 光學相干斷層掃描（optical coherency tomography, OCT）
 與IVM相對簡單的光學系統不同，光學相干斷層掃描是一種基于干涉測量的技術，用近紅外near-infrared （NIR）低相干光照射組織并檢測來自組織的反向散射光子，反射光與參考光束發生干涉，記錄干涉圖中不同深度組織反向散射光子的時間延遲，使用傅立葉變換將其重建為組織掃描圖像。OCT的掃描原理與超聲波類似，都在組織的z軸方向平面捕獲連續的線性圖像。改變掃描儀的角度，使光束沿x或y軸方向移動完成3D結構掃描。OCT可以在沒有造影劑的情況下對活體組織進行解剖學和生理學成像，常被用作一種無標簽成像技術。但圖像質量和信息水平高度依賴掃描程序和后續處理算法。如為了檢測血管，必須在相同的成像位置進行重復掃描并使用特定算法處理掃描信號以計算重復掃描的信號差。結合了造影技術之后，OCT分辨率得到顯著提高并可以擴展用于細胞和分子成像。如通過使用納米造影劑LGNR（large gold nanorods）或GNPR（gold nanoprisms）作血管內造影劑，OCT能夠觀察到皮膚表面1 mm以下的毛細血管，這是使用傳統無標記OCT無法做到的。Si等使用microbeads作為造影劑，成功監測了淋巴管內皮透明質酸受體（LYVE-1）的動態表達。OCT儀器的改進也增強了其分辨能力，因為圖像質量可能受散斑噪聲影響，光學改進后的OCT掃描系統SM-OCT（speckle-modulation OCT）能夠顯著強圖像對比度和分辨率。de la Zerda等人結合SM-OCT和造影劑GLNR，實現了對腦腫瘤小鼠模型中腫瘤細胞瘤相關巨噬細胞的體內成像，極大擴展了OCT對細胞成像的能力。John等人結合水冷電磁體，并使用鐵磁力作為造影劑，實現了對大鼠乳腺癌模型中過表達的HER2生物標志物進行分子靶向成像。

 

應用01-腫瘤解刨學成像
 

腫瘤解剖學包括形狀、大小、邊緣、血管和淋巴管，是臨床和臨床前腫瘤學研究的重要領域。腫瘤邊緣或邊界可視化對分析腫瘤進程、監測治療反應、指導癌癥手術中起到非常重要的作用。IVM通過基因編碼或靜脈注射熒光團使腫瘤細胞帶上標簽進行檢測，OCT通常用于檢測腫瘤與其周圍組織的內在對比差異確定腫瘤的邊緣。IVM常用于臨床前動物來研究腫瘤微環境，但最近有研究發現其在人胃腸癌和膀胱癌等內腔部位癌癥研究，以及檢測微小轉移性腫瘤中的臨床適用性。但臨床IVM仍面臨幾個問題，如染料漂白、組織自發光和非特異性結合熒光標簽導致的假陽性信號。OCT的優勢在于快速無標簽，可以大視野檢測腫瘤，使其在術中和術后評估腫瘤邊緣中很有優勢。

 腫瘤脈管系統是擴散癌細胞轉移、運輸免疫細胞和提供抗癌治療的主要路徑。因此無論是在基礎癌癥研究，還是在臨床檢測腫瘤進展、了解病理狀態、提供預后、測量治療反應方面，腫瘤脈管系統可視化都非常重要?；铙w血管成像是IVM和OCT最重要的功能之一。IVM能夠將紅細胞作為天然造影劑，使用線性極化或常規透照方法，測量出血管的直徑、長度、毛細血管間距、分支模式。long-circulating AngioSense或葡聚糖偶聯的熒光染料等高分子示蹤劑，可以用來在血管泄露到血管外腔之前顯示出血管邊界。在一項術中IVM研究中，對黑色素瘤患者靜脈注射熒光染料發現，約50%的腫瘤血管并不支持血流，而且人腫瘤血管的直徑比之前通過免疫組化方法預測的直徑要大。使用OCT對腫瘤脈管系統進行無標簽成像的方法很多，如斑點強度方差、相位方差、復信號方差等。這些方法都基于對血管中紅細胞動態散射的檢測。Bouma等同時使用OCT和IVM，對臨床前小鼠移植模型的MCaIV腫瘤脈管系統進行了成像，發現對最小的表面毛細血管進行成像時多光子熒光顯微鏡表現*，但OCT在識別腫瘤中心區域更深處血管和一些熒光示蹤劑泄露的區域方面具有優勢（圖2）。OCT能夠輕易觀察到深度1 mm以上的血管，但多光子熒光顯微鏡只能達到約600 μm。OCT的瞬時分辨率是IVM的十倍左右。OCT能夠快速顯示腫瘤的脈管系統，包括與主血管的連接性，這可以彌補IVM的分辨率高但深度不夠。

 無標簽OCT除了可以應用于腫瘤血管成像，還能用于檢測光線顯著減弱的深處腫瘤血管和血細胞比容低的精細血管結構。Relle等靜脈注射LGNRs作為外源性造影劑，使用OCT掃描顯示出了傳統OCT方法無法檢測到的更深處的腫瘤微血管（圖3A-D）。Si等報道稱金納米棱鏡（gold nanoprisms, GNPRs）做血管內造影劑，與無標簽OCT方法相比，分別在黑色素瘤和腫瘤周圍組織中多檢測到約60%的血管和約40%的毛細血管（圖3E-H）。

 除研究血管生成外，IVM和OCT在淋巴管內皮發育和腫瘤周圍淋巴管生成的生理病理學研究中也有值得注意的發現。IVM對小鼠尾部腫瘤進行微淋巴管造影術發現，腫瘤周圍的淋巴管是增生的。這些腫瘤周圍淋巴管的直徑甚至比過表達VEGFC的腫瘤里的還大。但過表達VEGFC并不會誘導腫瘤內功能性淋巴管的形成。IVM微淋巴管造影技術通常要局部注射熒光染料并拍攝淋巴管對染料的吸收和排出（表2），但這會使注射部位附近精細結構模糊。無標簽OCT對淋巴管成型的方法是檢測含有血管形狀和低OCT信號的組織結構，因為淋巴液是光學透明的，與周圍組織相比幾乎不反射光。利用這種*的光學特性，已經開發了很多無標簽OCT淋巴管造影技術。Vakoc等發現可以用該方法分離腫瘤周圍的淋巴管網絡。皮下注射OCT造影劑能夠增強對淋巴結構的造影。例如，在小鼠耳朵離散位置分別注射兩種不同類型的LGNRs，可以看到淋巴管。IVM和OCT方法是研究腫瘤周圍淋巴網絡的有力工具，但活體腫瘤內淋巴網絡由于脈管更深、管腔塌陷和無功能的腫瘤內淋巴管等原因，還是很難進行成像。




  圖2. 小鼠MCaIV腫瘤模型的OCT和IVM做造影圖像。（A，B）對移植在背部皮膚褶室中的MCaIV腫瘤使用OCT和MPM進行寬視野成像。MPM圖像需要收集并將30-40張3D圖像堆疊以制成與OCT一致的視野。MPM能分辨出組織中深達400 μm的血管。OCT成像時間10 min，MPM成像時間2 h。使用低放大率透鏡可減少MPM成像時間，但要犧牲分辨率和穿透深度。（C，D） A和B圖中上部方框區域的高倍放大，OCT被增強能看到深層血管，MPM血管滲透區域形態學區分清晰。（E，F） A和B圖中下部方框區高倍放大，MPM和OCT獲得的更精細血管結構的更多細節。（G-I）將自動血管追蹤用于OCT和MPM得到的圖像上，量化OCT造影的分辨率，同時驗證OCT的形態學測量。

 

應用02-腫瘤生理學成像
 

通過血液散播造影劑需要通過脈管系統輸送，經血管交換進入組織，擴散或對流穿過間隙空間，并被腫瘤邊緣的淋巴管清除，藥物向腫瘤的有效輸送也要遵循相同的路徑。IVM成像研究發現，腫瘤中的血液灌注在空間和時間上是不均勻的，這表明腫瘤內資源分布不均可能導致腫瘤性質不均一，導致藥物處理和疾病進展出現差異。此外一些腫瘤中，平均紅細胞速度低于宿主血管，且與血管直徑無關，表明血液和間質壓力發生了變化。

 OCT作為一種測量血流速度和血流動力學的定量工具已經得到了大量的應用。Doppler OCT （D-OCT）被用于測量動脈和靜脈中的軸向血流速度，但是這種技術不能檢測垂直角度和容易受到組織運動影響的血流。Merkle等人開發了動態對比光學相干斷層掃描（DyC-OCT），對在血管內示蹤劑（靜脈注射脂肪乳劑）通過視野時對其進行成像克服了這一限制。這項技術也可用于測量微血管血流動力學。

 了解腫瘤淋巴流動模式為研究腫瘤淋巴結轉移提供了生理學基礎?；铙w技術可精確測量毛淋巴管中的流體速度（表2）。IVM研究發現過表達VEGFC誘導小鼠皮膚淋巴管增生會減弱淋巴流動，并且腫瘤內沒有引流淋巴液的功能性淋巴管。

 

使用無標簽OCT或造影劑增強的OCT都能夠看到淋巴液。Blatter和同事開發了一種無標簽D-OCT方法測量淋巴液流速。最新研究中，出現了基于GNBPs的多路復用OCT造影劑，允許觀測多種生物過程如腫瘤內和腫瘤周圍的淋巴流動。一項研究表明，腫瘤內注射的造影劑會流到周圍淋巴管和前哨淋巴結中，皮下注射的造影劑也能夠流入腫瘤內部、周圍淋巴管和同樣的前哨淋巴結（圖3K）。

 

 圖3. 幾種可用于增強OCT腫瘤血管造影和多路淋巴造影的OCT造影劑。（A） LGNRs的透射電子顯微鏡圖像，平均長度107 ± 7 nm，平均寬度32 ± 2 nm，平均縱橫比3.4。（B） LGNRs的可見近紅外（Vis-NIR）吸收光譜，在815 nm處顯示出縱向等離子共振峰。（C，D）靜脈注射LGNRs前后，小鼠耳移植的U87MG腫瘤的光譜對比OCT圖像。LGNRs提高了OCT圖像中血管的對比度，使OCT能夠檢測腫瘤深處的小血管（白色箭頭）。（E） GNPR的TEM圖像，平均邊長約140 nm。（F） LGNRs的可見近紅外吸收光譜，1385 nm處顯示出縱向等離子共振峰。（G，H）靜脈注射0.75 nMPEGylated GNPR前和注射5 min后，帶有黑色素瘤的小鼠耳朵組織的正面投影OCT血管造影圖片。彩色圖顯示組織表面下方的脈管深度。注射后，可見腫瘤內約60%以上的微血管。（I）縱橫比不同的GNBPs（GNBP-Ⅰ和-Ⅱ）做多路OCT造影劑的TEM圖像。（J） GNBP-Ⅰ和GNBP-Ⅱ的近紅外光譜。（K）移植腫瘤的小鼠耳朵血管網絡流量門控光譜OCT圖像，左為注射造影劑前，中為腫瘤內注射GNBP-Ⅰ的腫瘤及周圍淋巴管，右為皮下注射GNBP-Ⅰ和GNBP-Ⅱ的腫瘤及周圍淋巴管。

 表2. 使用IVM和OCT技術進行的體內腫瘤成像

 
 

應用03-腫瘤細胞和腫瘤相關白細胞成像
 

了解腫瘤微環境中的細胞行為對于揭示腫瘤發育的潛在機制和開發新療法非常關鍵。IVM是研究腫瘤微環境中細胞行為的常用技術，包括腫瘤細胞和相關免疫細胞的遷移。了解腫瘤微環境的細胞行為對于闡明腫瘤發展的潛在機制和開發新的治療方法至關重要，可以幫助闡明癌癥的進展、消退、轉移以及對各種治療的反應。淋巴轉移是幫助腫瘤細胞從原始位置擴散到身體其他部位的關鍵過程。IVM已被用于識別淋巴轉移過程各步驟。例如，對鼠淋巴瘤模型中的淋巴結進行動態監測發現，脾和骨構建淋巴結后會產生浸潤的腫瘤細胞，并不是我們之前假設的那樣是從腫瘤原始位置運輸過來的。通過使用表達腫瘤特異性報告熒光團的轉基因小鼠，IVM可以動態監測淋巴管中的腫瘤細胞轉移。常規IVM必須在動物麻醉的情況下進行，但Pereira等也實現了某種情況下的無麻醉成像。隨著研究的深入，這可能會逐漸成為一個受關注的問題，尤其是需要進行幾天幾周甚至更長時間的成像觀察，或者需要對清醒或能夠對刺激產生即時反應的動物進行成像，或者麻醉可能影響成像的細胞和分子時。

 

腫瘤相關白細胞介導癌癥的原發過程和抗原發過程，在腫瘤微環境中發揮重要作用。腫瘤相關巨噬細胞和CD8+ T細胞是兩種重要的免疫細胞，會對多種癌癥免疫療法的療效產生實質性影響。通過利用先進的熒光標記技術，IVM能夠同時長期的追蹤腫瘤微環境中多種白細胞和治療因子，從而幫助闡明腫瘤微環境中白細胞的募集、粘附和行為，量化白細胞對各種治療劑的反應，同時幫助闡明導致癌癥免疫療法耐藥性的機制。Junankar等人使用real-time 2-photon IVM發現TAMs會吞噬結合到乳腺腫瘤小顆粒微鈣化上的雙膦酸鹽藥物。Arlauckas等人在抗PD-1免疫療法中同時對TAMs、CD8+ T細胞和治療因子的分布進行了30 min的跟蹤，發現抗PD-1單克隆抗體（aPD-1 mAbs）在注射后6-15 min會短暫結合CD8+ T細胞，但最終這些抗體會被臨近的TAMs捕獲并保留（圖4A）。隨著過度表達或缺乏相關分子的基因工程小鼠模型越來越多，前有熒光譜系追蹤模型和后有基因敲除模型，IVM能夠繼續幫助人們對腫瘤微環境進行更深入了解，揭開腫瘤-免疫系統相互作用的神秘面紗，改進癌癥治療方法。

 

OCT最近才被用于研究腫瘤微環境免疫細胞的遷移。與IVM相比，OCT成像視野更大，分辨率更高（表1），如掃描300 × 20 × 200μm體積的組，IVM通常需要1秒，而OCT通常需要0.02秒。de la Zerda等人報道了基于contrast-enhanced SM-OCT技術的白細胞縱向成像。用LGNR造影劑在小鼠原位膠質母細胞瘤模型中對TAMs和活化的小膠質細胞進行體內標記，由此對腫瘤內TAM遷移和分布進行了實時跟蹤（圖4B）。這使我們能夠詳細研究TAMs在體內的基本行為，包括它們在腫瘤內的分布異質性以及在調節增殖中的作用。除了白細胞追蹤，研究人員還實現了循環腫瘤細胞的體內追蹤。這項研究標志著OCTshouci用于檢測體內血液中的單個細胞。我們大可期待這一技術在動態檢測和量化活體內循環的腫瘤細胞中的應用效果。

 

Smith等人使用IVM結合熒光團標記的單壁碳納米管（single-walled carbon nanotubes, SWNTs），靜脈注射到小鼠中后，直接觀察到單壁碳納米管選擇性積累到單核細胞中，并觀測到了其自然運輸、外滲和進入腫瘤過程（圖4F-H）。研究發現單壁碳納米管通過進入炎癥單核細胞，作為“特洛伊木馬”溢出并進入腫瘤中，導致觀察到非常高的腫瘤積聚性。或許這些單壁碳納米管可用于對炎性單核細胞運輸到的部位進行成像，或用于治療這些炎性單核細胞，因為炎性單核細胞與許多疾病包括從癌癥到動脈粥樣硬化到神經退行性疾病還有關節炎，都有關系。因此，結合使用納米材料，可以通過IVM在微尺度上實現血管和腫瘤動力學可視化，這為單核細胞/巨噬細胞成像，癌癥及其他疾病的治療提供了潛在基礎。IVM能做到多顏色和高分辨率，可用于確定單壁碳納米管或其他納米材料在疾病部位的定位，還可以通過評估細胞殺傷（如注射凋亡信號試劑）、激活和向其他細胞表型分化來進行治療方法的調整。但要同時進行多維分析，要觀察各種細胞類型、血管特征、細胞狀態和分子的高度交互系統，則需要更多顏色，更新的算法。

 

 

 圖4. IVM和OCT追蹤腫瘤相關巨噬細胞（TAM）和單核細胞遷移。（A）在使用MC38–H2B-mApple腫瘤小鼠模型進行抗PD-1免疫治療期間，對TAMs（Pacific blue–dextran納米顆粒標記）、T細胞（YFP標記）和抗PD-1抗體（AF647標記）進行縱向和同時IVM成像。黃色箭頭表示PD-1抗體在6-15min時與CD8+ T細胞結合的位點，21min以后在巨噬細胞內的位點。比例尺30 μm。（B）注射40h后腫瘤（帶顏色）和周圍腦實質（灰色）的正面SM-OCT圖像。（C）腦腫瘤中TAM遷移的time-resolved OCT圖像。斑點方差檢測腫瘤脈管系統（紅色）。（D，E）從注射后40h到注射后41.5h隨機選擇的TAMs的遷移軌跡圖。（F）單壁碳納米管與PEG非共價包被示意圖，疏水段（淺藍色）與單壁碳納米管表面相連，親水段（綠色）與Cy5.5熒光染料（紅色球體）和/或RGD（或RAD）肽（藍色環狀球結構）相連。（G）腫瘤脈管系統內，負載單壁碳納米管的循環單核細胞的IVM熒光圖像（圈出的細胞為例）。（H）腫瘤區域的代表性活體顯微圖片。

 

應用04-分子標志物和腫瘤動力學的成像
 

IVM和OCT都能夠通過使用合適的造影劑對腫瘤細胞表面過表達的生物標記物進行成像。已有研究使用OCT進行了單個癌癥標志物的分子成像，結合新的OCT造影劑有望在未來實現多重成像。IVM已經廣泛用于癌癥生物標志物的多重標記和成像，在腫瘤異質性研究中得出很多成果。由于IVM分辨率更高，在監測藥物輸送和腫瘤進展中涉及的各種細胞內分子事件方面具有*的優勢，如基因表達/調節、酶活性和信號通路。還可以用于監測許多其他納米粒子，新抗體或小分子藥物的在體內的循環和生物效應。監測酶的活性需要分子探針，可以通過與酶或其產物的特定相互作用來改變其光學性質。已有研究使用近紅外光源監測組織蛋白酶B和許多其他酶的活性。為使基因表達可視化，需要開發由特定啟動子控制的各種熒光蛋白（例如綠色熒光蛋白）的轉基因細胞系或動物。如Leben等人利用這種方法研究了神經系統疾病中NAD（P）H代謝的動力學。這些研究的測量顯示，癌癥的基本分子驅動因素，如對新治療的遺傳或酶反應，可能是癌癥治療的關鍵靶標部分。
 

對比增強的OCT技術（contrast-enhanced OCT）能夠對體內細胞生物標志物進行分子成像。Boppart等人使用磁動OCT（magnetomotive-OCT）和結合了抗體的鐵磁氧化鐵納米粒子做造影劑，在乳腺癌大鼠模型中實現了HER2的靶向分子成像。隨著外加磁場的變化，納米粒子旋轉并攪動周圍細胞，因此通過OCT可以檢測到的局部光學散射特性的變化。Si等人研究發現，具有靶向性的聚苯乙烯MBs也可以用作光學相干斷層掃描的分子造影劑。LYVE-1是一種對腫瘤轉移和炎癥敏感的重要淋巴生物標志物。靶向結合了LYVE-1的MBs發生相位變化可使用OCT進行檢測，從而實現LYVE-1在小鼠炎癥模型中的動態表達可視化。這項技術還可能用于與腫瘤誘導的炎癥和淋巴管生成相關的分子動力學研究中。已經有研究正在開發新的contrast-enhanced OCT方法，以實現監測更多腫瘤相關淋巴管和血管生物標志物，包括VEGFR-2、VEGFR-3、血管細胞粘附分子1、血小板和內皮細胞粘附分子1等等。 
 

應用05-IVM和OCT在腫瘤成像中的結合

 IVM和OCT是互補的技術，將兩者結合的多模式系統可以在臨床前環境中增強癌癥成像，并在臨床環境中支持更好的惡性腫瘤診斷。已經有研究在內窺鏡或膀胱鏡中將二者結合起來，顯示了增強腫瘤學特征的潛力。IVM和OCT結合成像技術的一個關鍵優勢是可以同時表征腫瘤的解剖結構和分子特征。Iftimia等人報道了一種fluorescence-guided OCT方法，在結腸直腸腺瘤的臨床前小鼠模型中，皮內注射RGD肽結合的熒光微粒后，shouci使用IVM篩查了結腸癌定位，然后使用OCT驗證IVM識別的腫瘤組織并檢查結腸癌形態學。還有研究人員進一步報道了fluorescence-guided OCT膀胱鏡在大鼠膀胱癌早期檢測中的應用。該方法還能夠減少膀胱癌檢測中的假陽性。Tang等人將高靈敏度熒光層狀光學斷層成像（fluorescence laminar optical tomography）和OCT內窺鏡用于C57BL/6J-Apc^Min/J小鼠模型中結腸癌的結構和酶活性成像。Li等人使用同步配準近紅外熒光成像（simultaneous coregistered NIR fluorescence imaging）和OCT，開發了一種多模式內窺鏡系統，通過同時觀察胃腸道的微血管和形態學變化，可以實現早期檢測結直腸癌。在F344-Apc^PircUwm大鼠模型中，該成像技術能夠成功識別和區分正常結腸、增生xingxi肉、腺瘤xingxi肉和惡性腺瘤。目前大多數OCT造影劑都是近年出現的，尚未得到FDA批準，但這并不妨礙我們期待在臨床結合使用這兩種技術，會對形態學和分子成像有極大改善。

 

結束語
 

IVM和OCT在分辨率和成像深度方面是互補的光學成像技術，各自在基礎癌癥生物學研究和臨床腫瘤學研究中有*引用。IVM分辨率高（＜0.5 μm），但組織穿透有限（＜600μm）。OCT分辨率（5-10 μm）較低，但組織穿透性好（2-3mm）、掃描速度更快、視野更寬。二者都可以標記和無標記方法使用。IVM結合多種標記方法后能成為一種非常強大的工具，可用于癌癥藥物輸送、基因表達和基礎癌癥研究中酶活性的細胞跟蹤和分子成像。多諧波生成等無標記技術使IVM能夠對腫瘤微環境的亞細胞結構成像，如細胞外基質和類脂體。OCT與原本是一種無標記技術，用于腫瘤解剖成像和腫瘤邊緣檢測，更新迭代的光學設計和成像算法使成像能力得到顯著提高。新興的造影劑和標記技術擴展了OCT在活體癌癥的生理、細胞和分子成像方面的能力，開辟了基礎癌癥研究和臨床腫瘤學研究的新領域。表2總結了各種新興的IVM和OCT技術，這些技術已用于癌癥的解剖學、生理學、細胞學和分子成像。
  未來在光學設計、算法開發和造影劑方面創新使用，將進一步增強臨床前和臨床癌癥成像效果，并實現更多臨床腫瘤學應用。隨著新的造影劑、標記技術和算法的進步，擴展可復用性可能是未來IVM和OCT的主要技術進步方向。例如，光譜分離技術的發展允許使用MPM同時激發和檢測在不同細胞和組織區室中表達的七種熒光團，可以分辨更多的標記，并獲取更多關于活體內癌細胞類型、細胞狀態和組織結構的信息。將體內光學成像與電子顯微鏡成像、流式細胞術、RNA測序和蛋白質組學相結合，可以進一步擴展IVM和OCT在分子癌癥研究方面的應用。除此之外，先進的計算機算法、云計算和人工智能的發展也將極大促進未來大型IVM和OCT數據集的分析。最終會極大促進我們在早期癌癥檢測、癌癥類型分類、腫瘤內異質性繪圖、治療反應監測以及成像結果與下游分子分析等研究中的進展。

參考文獻：

Si, P. , Honkala, A. , Zerda, A. D. L. , & Smith, B. R. . (2020). Optical microscopy and coherence tomography of cancer in living subjects.