視覺研究中，視網膜疾病的小動物模型非常重要，無創高分辨率的體內鼠視網膜成像是該領域應用的重要工具。加拿大研究人員Yifan Jian等介紹了一種用于小鼠體內視網膜高分辨率成像的定制傅里葉域光學相干斷層成像（FD-OCT）設備。為了克服小鼠眼畸變，在折射FD-OCT系統的采樣臂中引入一個商用自適應光學系統。使用折射抵消透鏡減少了角膜的低階像差和鏡面反射。文章還描述了一種用于修正小鼠眼殘余波前像差的自適應光學（adaptive optics, AO）系統的性能，展示了有無AO校正的活體內AO FD-OCT圖像。體內成像結果表明視網膜圖像中毛細血管和神經纖維束的亮度和對比度得到了改善。文章以“Adaptive optics optical coherence tomography for in vivo mouse retinalimaging”為題發表于J BIOMED OPT。

 

背景
 

人類疾病的小動物模型是現代視覺研究的重要組成部分。嚙齒動物（如小鼠和大鼠）通常用于開發對抗致盲疾病的新療法。為了更好地觀察細胞的微觀結構、了解活體視網膜的分子過程，需要對嚙齒動物眼睛進行高分辨率視網膜成像。免疫組織學等技術可作為視網膜研究的金標準，但只能研究單個時間點，還可能需要使用許多動物。而無創成像使研究單個動物在治療過程中的動態過程和反應成為可能。
 

對于活體內眼成像，獲得細胞級分辨率通常需要大瞳孔及自適應光學（AO）實現。AO能夠校正眼睛折射表面引起的像差，實現衍射極限的橫向分辨率。使用AO結合眼底攝影、OCT和共焦掃描激光眼底鏡，已經實現了人感光器馬賽克的可視化。已知視力良好的年輕健康志愿者在適當瞳孔大小（3-4mm以下），不使用OA的情況下，可觀察到從中央凹偏心2°的錐狀馬賽克。然而接近中央凹處的錐狀或棒狀感光器密度要高得多，因此要想提高分辨率并使這些結構可視化，就需要大瞳孔尺寸和AO校正。
 

小鼠眼睛大小約為人類的1/8，但其數值孔徑（NA）是人類的2倍以上。而光學像差對圖像質量的影響隨著NA的增加而增加，這阻礙了小鼠體內高分辨率成像。為此科學家們做了很多補償相差嘗試：Biss等人的AO生物顯微鏡和Alt等人用于小鼠視網膜活體成像的AO SLO表明，AO校正單色像差提高了圖像的亮度和分辨率；Geng等人證明當一個引發長聚焦深度的小直徑波前信標入射到小鼠視網膜上時，Hartmann-Shack波前傳感器（WFS）中出現了一個雙斑點，而他們最新的AO共焦掃描激光檢眼鏡（cSLO）在活體小鼠視網膜中shouci觀察到了光感受器馬賽克。

與en face成像方式的cSLO相比，OCT的優勢在于能夠獲得視網膜結構的橫截面圖像，這一特性使得嚙齒動物縱向研究成為可能。除結構信息外，OCT功能擴展（如多普勒OCT和血流對比OCT）還能可視化血管網絡。
 

OCT圖像的質量在很大程度上受焦點大小、掃描長度、采樣密度影響，OCT B-scan平均技術也會影響散斑（相干噪聲）的尺寸和對比度。臨床OCT平均圖像質量的提高通常是通過斑點圖案的模糊來實現，因此橫向分辨率降低了2/3或更多。
 

本研究旨在探討提高OCT對小鼠視網膜成像的橫向分辨率的方法。研究人員將外目標透鏡與折射抵消眼底透鏡結合以減少小鼠眼像差，利用該技術，在小鼠視網膜體內成像過程中，可以通過增加NA來減小斑點的大小。為了確保光斑尺寸（橫向分辨率）的改善不會被因像差增加而產生的斑點模糊而抵消，將自適應光學系統集成到小鼠視網膜OCT成像儀中。使其能夠監測并校正折射誤差，從而改善聚焦光斑尺寸。體內成像實驗結果表明，可以觀察到橫向分辨率增加及散斑尺寸減小。
 

圖1 小動物AO FD-OCT系統示意圖。
 

 

結果
 

將麻醉小鼠的眼睛對準眼底透鏡，通過軸向平移眼底透鏡和小鼠進行適度調焦（圖1）。由于FD-OCT和波前傳感器（WFS）使用同一光源，通過觀察B-scan調整焦平面在小鼠視網膜上的位置，可以監測對WFS斑點的影響。圖2為來自WFS相機的代表性圖像，其中DM保持在推薦的“平坦”位置。圖2(a)數據在焦點未優化時獲得，B-scan中整個視網膜厚度普遍明亮，波前斑點較大。仔細觀察發現波前斑點中有兩個峰值，與已報道結果相似。圖2(b)中的WFS數據是調整外視網膜上的焦點位置后獲得。放大視圖中，WFS點似乎變得更圓，并且只包含一個單峰，這對于質心檢測和AO像差校正算法非常重要。在相應的同時獲得的B-scan中，與圖2(a)相比，視網膜外層的強度高于視網膜內層。
 

圖2 WFS相機圖像及相同位置同時獲取的相應對數標度B-scan。熱圖中一個WFS點（紅色虛線圓圈中）以較高的放大率顯示，在黑線位置提取相應的強度分布。（a）具有非優化焦點的WFS圖像。（b）優化光束聚焦于視網膜外層獲得的WFS圖像。
 

 

圖3(b-d)為成像期間，WFS在AO校正前后記錄的均方根誤差和Zernike系數測量值。在AO校正前，將小鼠眼睛沿光軸對齊，焦點設置在外視網膜。AO校正前的均方根誤差在0.2-0.6 μm范圍內，以散焦和散光為主。激活AO校正后，均方根波前誤差降低到50 nm左右。繪制了8只小鼠（僅右眼）校正前后每個Zernike系數的平均幅度（平均值標準偏差），展示系統性能（圖3e）。
 

圖3（a）用紙模在視網膜平面上測量系統殘余像差。（b）小鼠成像過程中RMS波前誤差的代表性軌跡。用AO FD-OCT成像小鼠視網膜時，（c）AO校正前和（d）校正過程中測得的相應Zernike系數。（e）對8只小鼠樣本測量校正前后Zernike系數和標準差的平均值。
 

 

圖4為小鼠視網膜定制標準分辨率FD-OCT系統的代表性圖像，以及來自具有類似光源（軸向分辨率）的AO FD-OCT系統圖像。有文獻也描述了用于獲取這些圖像的標準橫向分辨率嚙齒動物FD-OCT系統的光學系統。簡而言之，系統的高斯束腰(1∕e²)約6.5μm、焦深約308μm（足以容納小鼠視網膜的全部厚度）。標準分辨率FD-OCT圖像的采集和處理與AO FD-OCT系統圖像保持一致。圖5中的標準分辨率B-scan由1.5 mm橫向掃描長度獲得。所有主要的視網膜層都可以在圖像中識別，且似乎都是明亮的。黃色虛線框中的插圖由AO FD-OCT系統獲得，所用小鼠與標準分辨率FD-OCT系統成像所用小鼠相同品系。插圖中，與標準分辨率FD-OCT圖像相比，AO FDOCT光束聚焦在比視網膜內層更亮的視網膜外層。如預期，AO FD-OCT圖像中觀察到的斑點尺寸明顯小于標準分辨率FD-OCT圖像中的，從而增強了視網膜層的可見性。
 

圖4 普通嚙齒動物OCT B-scan與高分辨率AO-OCT B-scan（AO-ON采集黃色虛線框內）的比較。圖像均來自C57BL/6J（色素沉著）小鼠，由20次運動校正B-scan平均產生。數據均采用對數強度標度。AO FD-OCT插圖上看到的斑點尺寸較小。比例尺100μm。
 

 

為了可視化AO系統對B-scan的影響，在AO系統關閉和打開的情況下，對同一視網膜位置采集了幾組數據，并用線性強度標度顯示結果。圖5(a)為AO系統關閉（OFF）時的圖像（flat DM），物鏡焦點在外視網膜上。圖5(b)為AO開啟（ON）時聚焦于外視網膜的B-scan，圖5(c)為聚焦于內視網膜的B-scan。AO校正激活（AO-ON）時，B-scan更亮（圖5右）。例如當AO被激活并聚焦在外視網膜時，OLM的測量強度增加了約3倍（圖5a和b）。焦點偏移的效果可以通過圖5(b和c)中相應視網膜層的強度變化來觀察。
 

圖5 相同偏心率下獲得的C57BL/6J（色素沉著）小鼠視網膜體內OCT B-scan圖像（左），及深度-強度曲線（右）。（a）AO關閉時（DM flat）獲取，（b）AO激活并將焦點設置在外視網膜時獲取，（c）AO激活并通過AO軟件將焦點轉移到內視網膜時獲取。圖像（a）、（b）和（c）通過平均20次B-scan生成，并以線性強度標度呈現。比例尺50μm。
 

 

激活AO系統后，可以通過改變AO控制軟件中的離焦量來調整焦平面位置。在小鼠視網膜的B-scan圖像中，可以實時觀察到焦平面位置的變化，因為焦平面上各層的亮度顯著增加。從光柵掃描獲得的AO FD-OCT體積式圖中提取小鼠視網膜的en face圖像，垂直疊加的B-scan幀間距為0.6μm。圖6為視網膜神經纖維層（RNFL）、內網狀層（IPL）和外網狀層（OPL）的代表性圖像。橫截面圖像中括號所示為聚焦層及創建en face圖像所需的像素范圍。在同一位置采集四組體積式數據，用相同參數進行后處理，并在相同的線性強度標度上呈現。黃色虛線框中的圖像數據沿短軸平均，以生成右側的強度圖（藍色線表示AO-ON，紅色虛線表示AO-OFF）。AO激活后RNFL中神經纖維以及IPL和OPL中毛細血管的銳度和亮度得到改善（圖7）。在AO-OFF情況下，只有OPL（圖6f）具有足夠的對比度以使得能夠與對應的AO-ON圖像（圖6c）進行比較，右欄的線形圖形中可觀察到毛細血管強度有2-3倍的增加。
 

圖6 用AO FD-OCT系統體內獲得的小鼠視網膜橫截面圖像。通過改變AO控制軟件中的離焦量，將焦平面設置在視網膜內部。B-scan中括號所示的軸向深度代表不同視網膜層的en face投影，分為AO-ON時（a-c）和AO-OFF（DM平面）時（d-f）。比例尺30μm。
 

 

圖7顯示了與圖6所示不同的動物視網膜圖像。可視化了不同的毛細血管叢層和感光層（PRL），可見強度和分辨率提高（視網膜毛細血管寬度提高）。圖7(c和g)中的綠色虛線框表示在AO打開和關閉的情況下測量幾個不同尺寸毛細血管寬度的位置。相應的折線圖已標準化（圖7底部1、2和3）。平均而言，用AO-ON測量的毛細血管直徑比AO關閉時約窄2.5×。
 

圖7 用AO FD-OCT系統體內獲得的小鼠視網膜截面和en face圖像（IPL、INL、OPL和PRL）。通過改變AO控制軟件中的離焦，在感興趣層上調整焦平面，如B-scan圖像中的紅色括號。B-scan中括號所示的軸向深度分別表示AO-ON（a-d）和AO-OFF（DM平面）（e-h）時同一位置不同視網膜層的en face投影的位置。底部為c和g中標記1、2和3的位置處毛細血管圖像強度的標準化線圖。比例尺30μm。
 

 

結論與討論
 

本文介紹了一種用于小動物視網膜成像的AO FD-OCT系統，系統使用同一光源做成像光源和波前傳感光源。為了便于小鼠成像，使用眼底透鏡幫助對齊閉并消除角膜屈光。體內實驗結果表明，小鼠視網膜圖像中毛細血管和神經纖維束的亮度和對比度得到了改善。

 

自適應光學視網膜成像的關鍵是精確的波前感知。對于小動物如鼠，尤其具有挑戰性。本文AO FD-OCT系統的設計特點之一是使用了眼底透鏡消除空氣-角膜界面的折射，而不是用物鏡聚焦光。該方式通過組合移動眼底透鏡和眼睛，使光可以很容易地聚焦在外視網膜上，從而獲得單峰高質量的波前圖像。此外，通過使用單一光束進行波前傳感和FD-OCT，能夠通過觀察B-scan實時監測成像光束聚焦的視網膜區域。由于被成像的眼睛與眼底晶狀體接觸，有效減少了角膜干燥和混濁。使用物鏡將光聚焦在視網膜上可能會使產生圖像平面的曲率場與小鼠視網膜的曲率不匹配，但本文不存在這個問題，因為AO FD-OCT掃描的區域很小，如圖5-7中的B-scan圖像所示，視網膜表面在短距離內是平坦的。

 

當前的系統設計中，沒有使用小鼠眼球的全部NA。預計分辨率需要提高兩倍才能用高對比度來分辨橫截面圖像和en face圖像中完整的光感受器馬賽克。與cSLO不同，OCT的軸向分辨率取決于光源的帶寬；為了獲得超高的軸向分辨率，需要很寬的光譜帶寬。這給AO-OCT帶來了額外的挑戰，因為隨著光譜變寬，色差將開始影響光斑大小。需要進一步詳細研究這些色差的影響，以利用小鼠眼睛的完整NA。此外，焦點的深度與光斑的大小相耦合；光斑尺寸較小會使焦點深度非常小，小于PRLs厚度。所幸OCT靈敏度非常高，離焦結構仍然可見，但強度和分辨率降低。

未來研究需要提高系統的分辨率和聚焦深度。首先使修改屈光性AO系統，以便通過更大的瞳孔大小對小鼠進行成像，從而提高可實現的理論橫向分辨率。此外在嚙齒動物AO-OCT系統中加入SLO成像通道（類似Zawadzki等人提出的人視網膜成像設計），將允許使用光遺傳學中的新型熒光分子探針，從小鼠體內同時獲得結構和潛在功能數據。另外在不犧牲AO提供的橫向分辨率的情況下，探究延長AO-FDOCT系統聚焦深度的方法。已知幾種可能的高NA OCT成像解決方案，包括使用動態聚焦、實現貝塞爾光束成像或在AO-OCT系統中引入附加像差等。最終的目標是利用自適應光學技術提高橫向分辨率，實現體內光感受器的細胞級分辨率成像。
 

參考文獻：Jian, Y. ,  R. J. Zawadzki , and  M. V. Sarunic . "Adaptive optics optical coherence tomography for in vivo mouse retinal imaging." Journal of Biomedical Optics 18(2013).