從外周血提取DNA是一個經常遇到的問題,當然可以用試劑盒提取,不過代價還是有點大,并且不方便,定試劑總要等上幾天,如果血液標本不稀缺資源,不妨用一些簡便方法提取。
方法一
(1) 取抗凝血5ml在沉淀中加入15ml PBS,混勻,離心2000r/min10min。
(2) 將血漿轉至新的試管中,-70℃保存。
(3) 將血細胞轉入另一支試管中(10ml或50ml)加入盡可能多的冷的蒸餾水混勻。
(4) 將其插入冰內5~10min或放入-20℃15min。
(5) 將上述混合液從冰中或-20℃取出放至室溫,離心2000r/min20min。
(6) 棄上清,收集沉淀。
(7) 在沉淀中加入15ml PBS,混勻,離心2000r/min10min。
此步驟重復3次至沉淀為淡紅色或白色。
(8) 將沉淀轉入小管,加少量PBS,每分鐘5000r/min離心5min,去上清。
(9)沉淀-70℃保存。
方法二 簡化鹽析法
取抗凝血500μl ,加入細胞裂解液Ⅰ1 ml (10 mmol/ L Tris2HCl ;10 mmol/L KCl , 10 mmol/ L MgCl2 , 2 mmol/ L EDTA 和2. 5 % TritonX2100) 混勻,6 000 r/ min 離心5 min ,重復裂解一次,
加細胞裂解液Ⅱ150μl (10 mmol/ L Tris2HCl ; 10 mmol/ L KCl , 10 mmol/ L MgCl2 , 2mmol/ L EDTA 和1 %SDS) 混勻,56 ℃恒溫箱孵育15 min ;
加飽和NaCl 150μl ;混勻,10 000 r/ min 離心5 min ;
小心吸取水相,加2 倍體積的無水乙醇,輕輕混勻,12 000 r/ min 離心5 min ,
棄上清,待干,加50μl 無菌雙蒸水溶解DNA ,備用。
方法三
取EDTA - NaI 抗凝血100μl 加入1. 5 ml 離心管中,加入1000μl 無菌去離子水,輕輕顛倒5~10次,5 000 r/ min 離心3 min ,棄去上清液1000μl ,
加入6 mol/ L Nal100μl ,混旋10 s ,加200μl 氯仿∶異戊醇(24∶1) ,混旋30 s ,
10 000 r/ min 離心3 min ,取上清液150μl 于另一離心管中,
加入90μl 異丙醇,混勻后,10 000 r/ min 5 min ,棄去上清液, 加入1 000μl 75 %無水乙醇洗滌沉淀2 次,再加入1 000μl無水乙醇洗滌沉淀2 次,
沉淀置56 ℃烘干20 min ,加入50μl 無菌去離子水或50μl TE 溶液
個人體會:方法一較復雜,需要用蛋白酶K,方法三不能保證蛋白被*去除,將來影響試驗,所以推薦方法二
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