高速逆流色譜相較于中低壓色譜經常用于粗提而言，高效液相色譜和高速逆流色譜都可以用于物質的精細分離，無論是把多種混合物逐一分開還是單純的要提高某一種物質的純度。

對于一種新的待分離提純的物質來說，無論是采用高效液相色譜還是采用高速逆流色譜，都需要借鑒已有的經驗摸索出適合該物質分離的方法，之后，將確定好的分離工藝放大到工業生產級別的制備型設備上，進行多次分離、批量生產。

那么，如何保證自動連續運行時，每個循環的分離都能得到同樣的結果就變得至關重要，否則，哪怕某一單次分離中發生小的時間漂移都會造成生產上整批分離結果的污染。

對于使用高效液相的分離來說，要保證分離一致性，會涉及到幾個相關因素的影響：分離柱、流動相、壓力、溫度、填料情況等。

而采用高速逆流色譜分離時，因無需填料，固定相使用可回收反復使用的溶劑，所以影響分離一致性的因素相對較少。

高速逆流色譜分離過程中，物質的出峰時間可以通過以下公式進行估算：

其中，V_C 是分離柱的體積， F 是流動相流速， Sf 是固定相保留率 （即體系平衡后剩余固定相與分離柱體積的比例）， D 是分配系數（物質分別在固定相和流動相中溶解度的比例）。

從上述這個公式可以看出，要保證多次分離一致性，至少要保證以下幾個因素在分離過程中要保持不變：

1)       柱體積

2)       流動相流速

3)       分配系數

4)       固定相保留率

其中，柱體積取決于分離時所用的高速逆流色譜系統，一旦設備確定，該體積也就固定不變。

流動相流速取決于分離時所設定的泵速參數。

分配系數取決于所選用的溶劑體系和溫度。如果分離過程中系統的溫度變化比較大，則可能引起分配系數的變化。

固定相保留率取決于多個因素，諸如分離轉速，溶劑體系構成等。實際分離過程中，如果轉速不穩定，則會帶來固定相保留率的變化。

從上述分析可見，設備的穩定性（轉速一致，溫度一致，管路堅固不漏液等）是保證分離效果的首要條件。其次，溶劑體系的穩定性也很重要，如果根據一定配比配置好的上/下相溶劑因較長時間放置而出現揮發現象，也會導致分離體系的實際構成發生變化，從而對分離一致性產生影響。

除此之外，待分離物質每單次分離時的上樣體積和濃度是否*相同，也是確保連續、批次生產分離結果一致性的因素之一。例如：采用手動上樣方法時，很可能會因為人工操作過程中難免出現的差異性，導致每次所上樣的體積不能*保持等量，其結果必然會出現出峰時間的變化。

為此，對于高速逆流色譜的多次分離過程來說，要保證多次分離的一致性，可以從以下幾個方面來保證：

1. 高速逆流色譜設備：選用比較穩定可靠的高速逆流色譜設備，能夠精確控制分離轉速，精確控制分離溫度，液體管路沒有漏液風險。

2. 上樣：選用自動上樣系統，保證分離時灌入同樣體積的固定相和樣品。

3. 泵：選用流速穩定的泵。

4. 溶劑配置：在多次分離開始前一次性配置好足夠量的固定相和流動相，對于可能揮發的溶劑，應采用有蓋或密封性好的容器進行存放，盡量不要把溶劑暴露在高溫環境中。

5. 樣品溶液配置：選用溶解度較好的一相作為溶劑來溶解待分離物質，在多次分離開始前一次性配置好足量的待分離物質溶液。確保樣品*溶解，防止長時間放置出現沉淀等改變上樣濃度的變化，建議可采用攪拌裝置對樣品溶液進行持續攪拌。

6. 自動化操作：采用自動化控制軟件進行批量處理。通過軟件實現自動泵入固定相/樣品/流動相，以及各目標化合物組分的收集、排廢等過程，規避人為因素導致的失誤發生，通過軟件設定分離方法，自動完成連續、不停機、多次的分離生產。

以下以江陰逆流科技有限公司的Superchrome-1L系統分離某天然產物粗提物為例。

該應用案例中的主要參數如下：

主機轉速：1200RPM，溫度：30℃，轉向：正向

固定相：正庚烷：甲醇：水 以一定比例混合靜置得到的上相溶液

流動相：正庚烷：甲醇：水 以一定比例混合靜置得到的下相溶液

樣品：30mL

流動相流速：20mL/min

   采用江陰逆流科技有限公司配套的逆流專用控制軟件創建方法，分別連續分離2次分離以及連續分離17次所得到的圖譜如下所示：

從以上兩個圖譜可以看出，無論是連續2次分離，還是17次分離，高速逆流色譜分離的出峰時間，峰高，峰型都非常一致。

        如果是類似上述案例中的物質，每次出峰保持穩定一致性的情況下，用戶可選擇在軟件上對不同閥門的切換時間進行設定即可實現所要組分的收集。

        如果用戶在實際操作多次分離過程時，因某種特定原因導致未能保證諸如溶劑體系，樣品溶液濃度等某種因素的一致性，則可能造成分離結果的變化，其現象為分離得到的峰型相近，但是出峰時間會出現前后短暫的漂移，這種情況下，如果單純通過時間區間進行閥門切換來收集組分就會造成不同組分的混合，而導致批量分離事故的發生。

而單純的定峰模式對于逆流色譜分離常見的多雜質，多雜峰的分離結果來說為了避免組分漏接就必須設定并接收冗余的雜質峰。為此，江陰逆流科技有限公司開發的逆流專用控制軟件除了提供常規定時、定峰收集模式外，還提供了一個按照時間區間的定峰收集模式。該模式可以實現當系統出現較小的出峰時間漂移情況下也能夠準確的對組分進行收集。

        該模式下，組分收集的開始時間通過三方面因素綜合判斷進行確定：時間區間，峰高，最小保持時間。當檢測器的輸出在時間區間內達到設定高度，且保持時間大于設定的最小保持時間后，系統自動切換輸出收集閥門，開始新組分收集。

        該模式下，組分收集的停止時間的確定因素同樣由三個因素確定：時間區間，峰高，最小保持時間。當檢測器的輸出在時間區間內降低到設定高度，且保持時間大于設定的最小保持時間時，系統自動切換輸出收集閥門，停止該組分收集。

        該模式的設定方式如下圖所示：

綜上所述，多次高速逆流分離結果的一致性，可以從設備，軟件，操作過程等多個維度來加以保證。