1、介紹

       蛋白質(zhì)化學(xué)家一直希望在中紅外區(qū)（mid-IR）跟蹤蛋白質(zhì)的折疊動(dòng)力學(xué)，以便更好地了解蛋白質(zhì)的折疊過(guò)程，并獲得折疊過(guò)程中二級(jí)結(jié)構(gòu)變化的信息。傳統(tǒng)上，動(dòng)力學(xué)停流裝置是耦合到傅里葉變換紅外（FTIR）光譜儀。盡管FT-IR技術(shù)的進(jìn)步和步進(jìn)掃描采集的使用，這種快速動(dòng)力學(xué)裝置的主要限制通常是FT-IR光譜儀的時(shí)間分辨率。最快的采集速度通常在30-50 ms范圍內(nèi)（甚至更長(zhǎng)），因此它與Bio-Logic SFM的幾毫秒死時(shí)間（使用FTIR池）不匹配。實(shí)際上，這些光譜儀是為穩(wěn)態(tài)研究應(yīng)用而設(shè)計(jì)的，干涉儀的使用限制了數(shù)據(jù)采集的速度。因此，用這種技術(shù)不可能觀察到短于100-200ms的快速動(dòng)力學(xué)過(guò)程。

       一些自制的紅外探測(cè)系統(tǒng)已在實(shí)驗(yàn)室中開(kāi)發(fā)1，以達(dá)到這種采集速度并獲得毫秒分辨率，但到目前為止，還沒(méi)有一個(gè)商業(yè)化。

圖1 SFM-4000與IRis-F1（IRsweep）連接。

性能參數(shù)：

·5ms死時(shí)間

·75-100 μl每次注射樣品體積

·臍帶容積200μl

·單、雙、三混

· 100 μm至500μm光程

·紅外光譜4μs采集時(shí)間

·0.3cm-1分辨率下1000光譜/秒連續(xù)反應(yīng)監(jiān)測(cè)

·10-3 AU單次注射的噪聲水平

       另一個(gè)限制是分光計(jì)的信噪比，因?yàn)樗c采集速度直接相關(guān)。具有更快采集速度的商用FT-IR光譜儀通常需要對(duì)多次停流曲線進(jìn)行平均，以提高信噪比，這在紅外區(qū)域內(nèi)需要處理珍貴或濃縮樣品時(shí)會(huì)出現(xiàn)問(wèn)題。

       為了克服傅立葉變換紅外光譜儀的采集速度和靈敏度問(wèn)題，IRsweep2公司研制了一種基于雙梳光譜的新型紅外光譜儀。IRsweep公司的IRis-F1光譜儀是一種雙梳光譜儀，專為快速動(dòng)力學(xué)測(cè)量而設(shè)計(jì)。本應(yīng)用說(shuō)明的目的是說(shuō)明如何將Bio-Logic SFM與IRsweep IRis-F1連接起來(lái)，以毫秒時(shí)間標(biāo)度跟蹤反應(yīng)，并觀察之前沒(méi)有見(jiàn)過(guò)的中紅外反應(yīng)現(xiàn)象。

2、什么是雙梳光譜？

       雙梳狀光譜儀的原理與傳統(tǒng)的傅里葉變換或色散光譜儀*不同。兩個(gè)緊密匹配的激光源發(fā)射的寬帶紅外光束（頻率梳）通過(guò)樣品后疊加在單個(gè)探測(cè)器元件上。檢測(cè)到的光的波長(zhǎng)是根據(jù)在探測(cè)器上觀察到的射頻信號(hào)的頻率來(lái)解析的。由于不需要運(yùn)動(dòng)部件，一次實(shí)驗(yàn)只需4微秒就能記錄到完整的紅外光譜。因此，如本應(yīng)用說(shuō)明所示，通過(guò)停流技術(shù)研究的毫秒反應(yīng)動(dòng)力學(xué)可以很容易地遵循在*信噪比下的紅外光譜特征。基于高功率激光源，雙梳光譜儀還具有高亮度，允許在強(qiáng)吸收溶劑中進(jìn)行高光譜和時(shí)間分辨率的測(cè)量。

3、實(shí)驗(yàn)裝置

       本應(yīng)用筆記中使用了SFM-4000和IRis-F1光譜儀（見(jiàn)圖1）。SFM-4000有3個(gè)混合器和4個(gè)注射器，由獨(dú)立的步進(jìn)電機(jī)驅(qū)動(dòng)，使用戶可以*控制體積、注射速度和混合比。SFM的FTIR附件與Iris-F1樣品室*兼容。

       流通池使用CaF2窗口，用戶可以通過(guò)改變窗戶之間的間隔物在100μm至500μm自由改變光程。在本應(yīng)用筆記中，安裝的是100μm光程，對(duì)應(yīng)是15μl的死體積（從最后一個(gè)混合器到流通池中心）。因此，使用3ml/s的流速，對(duì)應(yīng)的死時(shí)間為5ms。最后一個(gè)混合器直接集成到FT-IR附件中，以最小化死體積。

       SFM-4000主體通過(guò)臍帶連接器連接到FT-IR流動(dòng)池，臍帶將來(lái)自混合器2出口和注射器4的溶液輸送到最后一個(gè)混合器，進(jìn)入最終混合階段。通過(guò)硬截止閥與停止電機(jī)的同步來(lái)確保液流的瞬時(shí)停止。停止流量推送和IRis-F1之間的同步是使用5V TTL觸發(fā)器實(shí)現(xiàn)的。

4、β-乳球蛋白結(jié)構(gòu)改變

       β-乳球蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)在用三氟乙醇作為變性劑中從β-折疊到α-螺旋的快速轉(zhuǎn)變由Gerwert等人描述4。這種快速反應(yīng)用于演示SFM-4000和IRis-F1耦合的性能。

       二級(jí)結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變是通過(guò)1:1的比例混合濃度25mg/ml的在10%三氟乙醇/20 mM DCl的重水中的β- 乳球蛋白，與60%三氟乙醇/20 mM DCl的重水中（見(jiàn)圖2），導(dǎo)致三氟乙醇的濃度變化從10%V到35%V。

圖2用于β- 乳球蛋白反應(yīng)的混合序列

       用氘化水和鹽酸來(lái)避免H2O在1650cm-1處的強(qiáng)背景吸收。實(shí)驗(yàn)采用每種溶液100μl和3 ml/s的總速度注入，導(dǎo)致5 ms的死時(shí)間。

       以每次4μs連續(xù)采集130毫秒得到光譜。對(duì)應(yīng)于反應(yīng)初始狀態(tài)的預(yù)觸發(fā)光譜被用作吸收光譜的背景。在后處理中，光譜在1ms內(nèi)進(jìn)行共平均，光譜以3cm-1進(jìn)行平均。

圖3 反應(yīng)10ms獲得的紅外光譜。可見(jiàn)的連續(xù)偏移。

       圖3顯示了10 ms測(cè)量的紅外光譜的演變，1635 cm-1和1660 cm-1處的譜帶證實(shí)了快速中間體的存在，如Gerwert等人所觀察到的。

圖4 β-乳球蛋白結(jié)構(gòu)改變：DA時(shí)間痕跡， 4次停流注射的平均

       圖4顯示了通過(guò)減去1623 cm-1處的吸光度校正基線漂移后4次停流實(shí)驗(yàn)的平均值。反應(yīng)在約100ms內(nèi)完成，但在10ms以下的早期可以獲得非常明確的信號(hào)。

5、結(jié)論

       使用標(biāo)準(zhǔn)FT-IR和臍帶連接器附件，Bio-Logic SFM可以很容易地耦合到Iris-F1雙梳光譜儀。使得小于10ms的生化反應(yīng)動(dòng)力學(xué)可以在中紅外區(qū)進(jìn)行研究，而傳統(tǒng)的紅外光譜實(shí)驗(yàn)是受限的。

       利用IRis-F1，在10-3 AU（吸光度單位）下以1ms的時(shí)間分辨率獲得單次停流注射的吸光度譜。共同平均多次注射或降低時(shí)間分辨率，靈敏度可以進(jìn)一步提高。

       所述實(shí)驗(yàn)僅使用的SFM-4000兩個(gè)注射器，但如果用戶希望編程自動(dòng)濃度研究或雙重混合實(shí)驗(yàn)，則可以使用額外的兩個(gè)注射器，在這種情況下，使用一條臍帶線作為延遲線來(lái)老化第一次混合。SFM-2000和SFM-3000也可以與IRis-F1光譜儀耦合。

參考文獻(xiàn)：

1) J. Tang, F. Gai, A Millisecond Infrared Stopped-Flow Apparatus. Applied Spectroscopy. 

2) A. Hugi, G. Villares, S. Blaser, H.C. Liu, J. Faist, Mid-infrared frequency comb based on a quantum cascade laser. Nature 

3)  Kauffmann, E., Gerwert, K. et al.