組織切片伴隨著顯微鏡技術和免疫實驗等的發展而得到廣泛的應用。對本文其中的冰凍切片、石蠟切片、碳蠟切片、超薄切片、塑料切片等幾種常用的實驗方法相關操作步驟進行介紹。

冰凍切片

是免疫組織化學染色中的一種切片方法。其優點是能夠較完好地保存多種抗原的免疫活性，尤其是細胞表面抗原更應 采用冰凍切片。新鮮的組織及已固定的組織均可作冰凍切片。

冰凍時，組織中水份易形成冰晶，往往影響抗原定位。一般認為冰晶少而大時，影響較小，冰晶小而多時，對組織結構損害較大，在含水量較多的組織中上述現象更易發生。冰晶的大小與其生長速率成正比，而與成核率(形成速率)成反比，即冰晶形成的數量愈多則愈小，對組織結構影響愈嚴重。因此，應盡量降低冰晶的數量。Fish認為冰凍開始時，冰晶成核率較慢，以后逐漸增加，其臨界溫度為-33。C, 從-30。C降至-43。C之間，成核率急劇增加達1018，然后再減慢。基于上述理論可采取以下措施減少冰晶的形成。

(1)速凍，使組織溫度驟降，縮短從-33。C43。C的時間，減少冰晶的形成。其方法有二：

①干冰-丙酮(酒精)法：將150-200ml丙酮(酒精)裝入小保溫杯內，逐漸加入干冰，直至飽和呈粘稠狀，再加干冰不再昌泡時，溫度可達-70℃C，用一小燒杯(50-100ml)內裝異戊烷約50ml，再將燒杯緩慢置入干冰丙酮(純酒精)飽和液內，至異戊烷溫度達-70℃時即可使用。將組織(大小為1cm×0.8cm×0.5cm)投入異戊烷內速凍30-60s后取出，或置恒冷箱內以備切片，或置-80℃低溫冰箱內貯存。

②液氮法：將組織塊平放于軟塑瓶蓋或特制小盒內(直徑約2cm)，如組織塊小可適量加OCT包埋劑浸沒組織，然后將特制小盒緩緩平放入盛有液氮的小杯內，當盒底部接觸液氮時 即開始氣化沸騰，此時小盒保持原位切勿浸入液氮中，大約10-20s組織即迅速冰結成塊。取出組織冰塊立即置入-80℃冰箱貯存備用，或置入恒冷箱切片機冰凍切片。

(2)將組織置于20%-30%蔗糖溶液1～3天，利用高滲吸收組織中水分，減少組織含水量。

影響冰凍切片的因素較多，因此，技術難度較大，選擇好的冰凍切片機是保證切片質量的關鍵。目前冰凍切片機有兩類：

①恒慢冰凍切片機(Cryastat)：為較理想的冰凍切片機，型號很多，但其基本結構是將切片機置于-30℃C低溫密閉室內，故切片時不受外界溫度和環境影響，可連續切薄片至2-4μm，*能滿足免疫組織化學標記要求。切片時，低溫室內溫度以-15℃～18℃為宜，溫度過低組織易破碎，抗卷板的位置及角度要適當，載玻片附貼組織切片，切勿上下移動。

②開放式冰凍切片機：包括半導體致冷切片機和甲醇致冷切片以及老式的CO2、氯乙烷等冷凍切片機。切片時暴露空氣中，溫度不易控制，切片技術難度 大，在高溫季節 ，切片更加困難，且切片厚8～15μm，不易連續切片，但其優點是價廉，國內有生產。

冰凍切片后如不染色，必須吹干，貯存低溫冰箱內， 或進行短暫預固定后貯存冰箱保存

石蠟切片

其優點是組織結構保存良好，在病理和回顧性研究中有較大的實用價值，能切連續薄片，組織結構清晰，抗原定位準確。用于免疫組化技術的石蠟切片制備與常規制片略有不同：①脫水、透明等過程應在4℃。C下進行，以盡量減少組織抗原的損失。②組織塊大小應限于2cm×1.5cm×0.2cm，使組織充分脫水、透明、浸蠟。③浸蠟、包埋過程中，石蠟應保持在60℃以下，以溶點低的軟蠟最好(即低溫石蠟包埋)。

以上全過程為18-24h，也可在室溫內使用自動脫水機代替。如組織塊小，直徑小于0.5cm，可用快速石蠟包埋切片，全過程只需4h左右。

石蠟切片為常規制片技術，切片機多為輪轉式，切片厚度2～7μm，應用范圍廣，不影響抗體的穿透性，染色均勻一致。由于甲醛固定、有機熔劑和包埋劑對組抗原有一定的損害及遮蔽，使抗原特征發生改變。有人報告經蛋白酶消化，可以改善光鏡免疫組化染色強度，常用的有胰蛋白酶、鏈霉蛋白酶及胃蛋白酶等消化法。石蠟切片應入37℃恒溫箱過夜，這樣烤片可減少染色中脫片現象。切片如需長期貯存，可存放于4℃冰箱內備用。

石蠟切片優點較多，但在制片過程中要經過酒精、二甲苯等有機溶劑處理，組織內抗原活性失去較多，有人采用冷凍干燥包埋法(Freeze drying embedding methed)，可以保存組織內可溶性物質，防止蛋白變性和酶的失活，從而減少了抗原的丟失。該法是將新鮮組織低溫速凍，利用冷凍干燥機(Freezing dryer)在真空、低溫條件下排除組織內水分 ，然后用甲醛蒸氣固定干燥的組織，最后將組織浸蠟、包埋、切片。此法可用于免疫熒光標記、免疫酶標記及放射自顯影。

振動切片

用振動切片機(Vibratotme)，可以把新鮮組織(不固定不冰凍)切成厚片20～100μm，以漂浮法在反應板進行免疫組織化學染色，然后在解剖顯微鏡下檢出免疫反應陽性部位，修整組織進行后固定，最后按電鏡樣品制備、脫水、包埋、超薄切片、染色觀察等。組織不冰凍，無冰晶形成和組織抗原破壞，在免疫組化染色前避免了組織脫水、透明、包埋等步驟對抗原的損害，能較好地保留組織內脂溶性物質和細胞膜抗原，主要用于顯示神經系統抗原分布研究。這種包埋前染色，尤其實用于免疫電鏡觀察。

塑料切片

塑料包埋切片常用包埋劑有甲基丙烯酸鹽類(Glycol methacrylate, GMA)及環氧樹脂類(Epon 812,618)，其優點是可以同時作光鏡和電鏡檢測，能相互對照所查抗原，定位準確。塑料包埋切片可切出比石蠟切片更薄的切片，光鏡切片可薄至0.5～2um，故稱半薄切片(Semithin section)。GMA保存抗原較好，不與組織產生共聚合，但形態學結構欠佳。環氧樹脂如Fpon和Araldite能較好地保存形態學結構，但在聚合過程中易和組織起作用，改變抗原結構。塑料包埋切片由于處理程序繁多，抗原活性易丟失。同時半薄切片進行免疫染色時，抗血清不易穿透樹脂，因此，塑料切片主要用于免疫電鏡的超微切片前定位。包埋前染色的標本，切片薄切片后不需染色，直接在相差顯微鏡下觀察免疫反應部位呈黑點狀，定位后進一步作超薄切片，這樣，可以明顯提高免疫電鏡陽性檢出率。

超薄切片

電鏡標本制作，應用超薄切片機(Ultrotome)進行切片。

碳蠟切片

碳蠟(Carbowax)，學名聚乙烯二醇(Polyethlene glycol, PEG)為水溶性蠟。根據其分子量不同，碳蠟有多種，如400、800、1000、1500、4000、6000等，用于組織包埋的有1500、4000兩種，其熔點分別38℃C和52。C左右，常溫下為固體石蠟狀，加溫熔化呈液體狀。

本法的特點是組織固定水洗后，不需脫水透明可直接浸蠟包埋，且切片方法與常規石蠟切片相同。切下的組織片漂浮水面后自然展開，碳虹迅速深化，組織片即可展平，制片過程簡單易行。

具體操作簡述如下：組織塊不宜過大，一般限定在1.5cm×1cm×0.1cm以內。①組織固定后充分水洗去除固定液，用濾紙吸干組織表面水。②將組織浸入碳蠟(1500)內，45℃30min。③再次浸入混合混合碳蠟液(1500和4000等量混合液)，52℃ 30min。④浸入等量混合碳蠟液(或根據氣溫、濕度變化調整4000和5000混合比例，如氣溫高濕度大可以4000：1500=3：2混合，反之，則2：3混合)。⑤用等量混合碳蠟或調整混合碳蠟包埋成組織蠟塊。⑥切片與石蠟切片相同。在操作過程中，碳蠟組織塊應盡量避免與水或冰接觸，貯存時應密封干燥冷藏。

本法優點是操作程序減少，時間縮短，組織不經有機溶劑損害、溫度低、抗原性保存比石蠟切片好，組織結構清晰。缺點是夏季室溫高時切片較困難，連續切片不如石蠟切片順利;由于碳蠟有強吸濕性，不易保存時間較長。