DOP-PCR (Degenerate Oligonucleotide–Primed Polymerase Chain Reaction)

技術原理：簡并寡核苷酸引物PCR，引物的3' 含6bp的隨機序列，可以隨機的和基因組DNA結合，從而實現(xiàn)對全基因組的擴增^[1]。

應用范圍：因為PCR的指數(shù)擴增特性，放大了基因組上不同序列之間的差異，因而導致擴增出的基因組覆蓋度較低。盡管如此，在1M bin size的水平上，DOP-PCR適合對染色體的CNV進行定量。

商品化試劑盒：Sigma-Aldrich, GenomePlex Single Cell Whole Genome Amplification Kit。

MDA (Multiple Displacement Amplification)

技術原理：2001年由Laskin團隊發(fā)明，使用隨機的六聚體引物和φ29DNA聚合酶進行反應，該聚合酶具有很強的鏈置換特性，能夠在等溫的條件下，擴增產(chǎn)生50~100kb的核酸片段。同時由于其3’-5’核酸外切酶活性和校對活性，φ29 DNA聚合酶具有很高的復制保真性^[2]。

應用范圍：MDA法比DOP-PCR擁有更高的基因組覆蓋度，φ29 DNA聚合酶的高效率及高保真性，使得MDA法在對SNV的分析，以及構建大片段文庫上有著顯著優(yōu)勢。但是，和DOP-PCR相同，MDA法依然是指數(shù)擴增，因此依然存在PCR反應的序列偏好性，然而，和DOP-PCR不同的是，這種偏好性并不能重復，因此MDA法不適合進行CNV的分析。

商品化試劑盒：Qiagen, REPLI-g Single Cell Kit。 

圖2 MDA技術原理^[4]

MALBAC (Multiple Annealing and Looping–Based Amplification Cycles)

技術原理：2012年由謝曉亮團隊發(fā)明，擬線性的擴增過程降低了指數(shù)擴增的序列偏好性。擴增引物的5’含有27bp的共同序列，3’是8bp的隨機序列，可以和模板在15~20℃的低溫下結合，經(jīng)過8~12個循環(huán)的擬線性擴增后，再對這些環(huán)狀的擴增子進行指數(shù)擴增^[3]。

應用范圍：MALBAC法的優(yōu)勢在于，雖然它依然存在一定的序列偏好性，但和MDA不同，MALBAC的這種偏好性在不同的細胞之間是可重復的，因此可以通過對參考細胞標準化后，進行CNV的分析；另外，由于其擴增的均一性，MALBAC法擴增的等位基因敲除率更低。MALBAC的弱點在于，它使用的聚合酶保真性不如φ29，因此MALBAC在檢測SNV時將會出現(xiàn)更多的假陽性；另外，由于它可重復性的序列偏好性，基因組上低擴增的區(qū)域有時會在擴增過程中丟失。

商品化試劑盒：Yikon, Single Cell Whole Genome Amplification Kit.

圖3 MALBAC技術原理[4]  由上述的分析可見，MDA和MALBAC各有優(yōu)劣，實際上在不同的文獻中，研究者也會根據(jù)研究目的的不同，采取不同的方式對基因組進行擴增，以滿足研究的需要[5-7] picoplex特殊隨機引物起始的熱循環(huán)擴增

picoplex技術相比于以往的PCR、MDA、MALBAC為基礎的單細胞全基因組擴增技術，操作簡便，擴增重復性良好。特別設計的隨機引物（參加US patent 8，206，913）能減少引物二聚體的形成，從而提高引物和模板的配對效率。

[1] Telenius H, Carter NP, Bebb CE, et al. Degenerate oligonucleotide-primed PCR: general amplification of target DNA by a single degenerate primer[J]. Genomics, 1992,13(3): 718-725.
[2] Dean FB, Nelson JR, Giesler TL, et al. Rapid amplification of plasmid and phage DNA using Phi 29 DNA polymerase and multiply-primed rolling circle amplification[J]. Genome Research, 2001, 11(6): 1095-1099.
[3] Zong C, Lu S, Chapman AR, et al. Genome-wide detection of single-nucleotide and copy-number variations of a single human cell[J]. Science, 2012, 338(6114): 1622-1626.
[4] Lei H, Fei M, Chapman A, et al. Single-cell whole-genome amplification and sequencing: methodology and applications[J]. Annual Review of Genomics & Human Genetics, 2015, 16(1).
[5] Wang Y, Waters J, Leung ML, et al. Clonal evolution in breast cancer revealed by single nucleus genome sequencing[J]. Nature, 2014, 512(7513): 155-160.
[6] Ni X, Zhuo M, Su Z, et al. Reproducible copy number variation patterns among single circulating tumor cells of lung cancer patients[J]. PNAS, 2013, 110(52): 21083-21088.
[7] Gawad C, Koh W, Quake S R. Single-cell genome sequencing: current state of the scienc.[J]. Nature Reviews Genetics, 2016.

華雅思創(chuàng)Rubicon授權代理，正品現(xiàn)貨，產(chǎn)品信息如下：

PicoPLEX^® WGA Kit：用于單細胞文庫構建的全基因組擴增解決方案

PicoPLEX^® DNA-seq Kit：單細胞 DNA 文庫制備技術，適用于 Illumina 所有 NGS 測序平臺

ThurPLEX^® DNA-seq Kit：更高的通量, 更好的性能, 用于所有 Illumina 的 NGS 平臺

 品牌/生產(chǎn)廠家           產(chǎn)品編號            產(chǎn)品名稱                                                     單位
Rubicon Genomics    R300381 PicoPLEX DNA-seq Kit                                          48
Rubicon Genomics    R300672 SMARTer® PicoPLEX® Single Cell WGA Kit        96
Rubicon Genomics    R300722 PicoPLEX Single Cell WGA Kit v3                          96
Rubicon Genomics    R400407 ThruPLEX DNA-seq 96D Kit                                  96

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