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過氧化氫酶的活性測定——高錳酸鉀滴定法
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一、原理
過氧化氫酶屬于血紅蛋白酶，含有鐵，它能催化過氧化氫分解為水和分子氧，在此過程中起傳遞電子的作用，過氧化氫則既是氧化劑又是還原劑。
R（Fe2+）+H2O2⇒R（Fe3++OH-）
R（Fe3++OH-）2+H2O2⇒R（Fe2+）2+2H2O+O2
據(jù)此，可根據(jù)H2O2的消耗量或O2的生成量測定該酶活力大小。在反應(yīng)系統(tǒng)中加入一定量的H2O2溶液，經(jīng)酶促反應(yīng)后，用標準高錳酸鉀溶液（在酸性條件下）滴定多余的H2O2。
5H2O2+2KMnO4+4H2SO4⇒5O2+2KHSO4+8H2O+2MnSO4
即可求出消耗的H2O2的量。
二、儀器和用具
研缽；三角瓶50ml 4個；10ml酸式滴定管；恒溫水浴鍋；容量瓶25ml 1個。
三、試劑
10%H2SO4；
0.2mol/L磷酸緩沖液PH7.8；
0.1mol/L高錳酸鉀標準液：稱取KMnO4（AR）3.1605g，用新煮沸冷卻蒸餾水配制成1000ml，用0.1mol/L草酸溶液標定；
0.1Mol/L H2O2：市售30%H2O2大約等于17.6Mol/L，取30%H2O2溶液5.68ml，稀釋至1000ml，用標準0.1Mol KMnO4溶液（在酸性條件下）進行標定；
0.1Mol/L草酸：稱取優(yōu)級純H2C2O2·2H2O 12.607g，用蒸餾水溶解后，定容至1L。
四、方法
1. 酶液提取：取小麥葉片2.5g加入pH7.8的磷酸緩沖液少量，研磨成勻漿，轉(zhuǎn)移至25ml容量瓶中，用該緩沖液沖洗研缽，并將沖洗液轉(zhuǎn)入容量瓶中，用同一緩沖液定容，4000r/min離心15min，上清液即為過氧化氫酶的粗提液。
2. 取50ml三角瓶4個（2個測定，2個對照），測定瓶中加入酶液2.5ml，對照瓶中加入煮死酶液2.5ml，再加入2.5ml 0.1mol/L H2O2，同時計時，于30℃恒溫水浴中保溫10min，立即加入10%H2SO4 2.5ml。
3. 用0.1mol/L KMnO4標準溶液滴定H2O2，至出現(xiàn)粉紅色（在30min內(nèi)不消失）為終點。
4. 結(jié)果計算：酶活性用每克鮮重樣品1min內(nèi)分解H2O2的毫克數(shù)表示：
酶活（Mg/g·Min）=（A-B）×VT×1.7FW×V1×t （3-2）
式中：A：對照KMnO4滴定毫升數(shù)（ml）；B：酶反應(yīng)后KMnO4滴定毫升數(shù)（ml）；VT：酶液總量（ml）；V1：反應(yīng)所用酶液量（ml）；W：樣品鮮重（g）；1.7FW：1ml 0.1mol/L的KMnO4相當于1.7mgH2O2。
五、注意
所用KMnO4溶液及H2O2溶液臨用前要經(jīng)過重新標定。
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