產品信息

產品描述

試劑盒內含兩種熒光染料DMAO和EthD-III，可分別將活細菌和死細菌染上綠色和紅色。其中DMAO是一種綠色核酸熒光染料，可染色活細菌和死細菌。EthD-III是一種紅色核酸熒光染料，僅染色細胞膜受損的死細菌。將DMAO和EthD-III混合使用染色時具有完整細胞膜的細菌呈現綠色，而具有受損細胞膜的細菌呈現綠色和紅色。結果可以通過熒光顯微鏡或流式細胞儀來分析，適用于大多數細菌類型。

細菌活力的常見標準是細菌在合適的營養培養基中繁殖的能力，稱為生長測定。該試劑盒通常與在液體或固體培養基中的生長測定結果有著很好的一致性。在某些條件下，膜損傷的細菌可能會在營養培養基中恢復并繁殖，而這種細菌在該測定中可能會被認為死亡。相反，一些具有完整膜的細菌可能無法在營養培養基中繁殖，但這些細菌在該測定中可能被認為是活的。因此，如果發現該檢測和細菌生長測定之間有相當大的差異，應該考慮上述的可能性。

光譜特性DMAO：Ex/Em=503/530nm（withNDA）； EthD-III：Ex/Em=530/620nm（withNDA）

產品組分

運輸與保存方法

冰袋（wet ice）運輸。儲存于 4ºC，至少可以儲存6個月。

注意事項

操作時請采取防護措施，穿防護服、戴一次性手套等。

使用方法

活、死細菌樣品對照制備

1. 在液體培養基中培養4 mL的細菌至晚期對數期。

2. 在EP管中準備兩份1mL的細菌液，并在5,000-10,000g條件下離心10-15 min。

3. 去除上清液，在其中一支EP管中加入0.3mL的0.85% NaCl重懸細菌，在另一管中加入1 mL的0.85% NaCl重懸細菌。

4. 在含有0.3 mL的0.85% NaCl的管中加入0.7 mL異丙醇，充分混合（終濃度為70% 的異丙醇）用以制備死細菌樣品。

5. 將兩種樣品在室溫下孵育1 h，每15 min混合一次。

6. 兩種樣品在5,000-10,000g條件下離心10-15 min。

7. 去除上清，在兩種樣品中加入1 mL的0.85% NaCl重懸細菌，并如步驟6再次離心。

8. 使用分光光度計測定兩種菌懸液在670 nm處的吸光值（OD670）。

9. 將兩種菌懸液（活的和死亡的）密度調整到108個細菌/ mL（OD670≈0.3），然后用0.85% 的NaCl以1：100稀釋，使終密度為106個細菌/ mL。

10. 如下所示混合兩種菌懸液以獲得所需的活細胞：死細胞比率。

表1. 活、死菌懸液按一定體積混合以達到所需的活細胞、死細胞比例

熒光顯微鏡的染色方法

1. 將1體積的DMAO和2體積的EthD-III在微量離心管中混合，充分混合后加入8體積的0.85% NaCl溶液以得到100×染料溶液。

2. 每100 μL菌懸液，加1 μL的100×染料溶液。

3. 充分混合，室溫下在黑暗中孵育15 min。

4. 取5 μL染色后的菌懸液滴在帶有18 mm方形蓋玻片的載玻片上。

5. 在熒光顯微鏡下觀察。活細菌和死細菌的熒光可以在任何標準的FITC長效過濾器下同時觀察到。或者，活的（綠色熒光）和死的（紅色熒光）細菌可以分別用FITC和Cy3（或TexasRed）通道觀察。

注意：
1) 在對細菌染色之前，必須注意除去生長介質的殘留。核酸和其他培養基組分可以以某種方式結合DMAO和EthD-III染料，導致不可接受的染色變化。簡單的洗滌步驟通常足以從細菌懸浮液中除去干擾介質組分。不建議使用磷酸鹽緩沖液，因為它們會降低染色效率。
2) 在開始正式實驗前應調節染料濃度來使DMAO標記活細菌、使EthD-III標記死細菌進行區分。*濃度可能因細菌菌株的不同而異。一般使用能夠提供充足信號的低染料濃度。以下條件針對大腸桿菌活/死細胞染色進行了優化。

細胞流式的染色方法

實驗開始前，請閱讀熒光顯微鏡染色步驟下的注意事項。

1. 根據表1，在EP管中加入11種不同比例的活細菌和死細菌。11種樣品中每種的體積1 mL。

2. 將12 μL的DMAO儲備溶液與24 μL的EthD-III儲備液在微量離心管中混合。11個樣品中的每個加入3 μL的混合染料，通過上下吹打幾次*混合。（注意：需要準備另外的對照細菌樣品用于單獨的DMAO和單獨的EthD-III染色）

3. 室溫下在黑暗中孵育15 min。

4. 使用流式細胞儀分析每個樣品，使用DMAO陽性細胞的FITC通道和EthD-III陽性細胞的PI或PE通道。