熒光定量PCR原理解析

  無論是對遺傳病（如地中海貧血和血友病）、傳染病（如肝炎和艾滋病）或腫瘤進行基因診斷，還是研究藥物對基因表達水平的影響，或者監控藥物和療法的治療效果，定量PCR技術都可以發揮很大作用。定量PCR技術的zuixin進展是實時熒光定量。該技術借助于熒光信號來檢測PCR產物，一方面提高了靈敏度，另一方面還可以做到PCR每循環一次就收集一個數據，建立實時擴增曲線，準確地確定CT值，從而根據CT值確定起始DNA拷貝數，做到了真正意義上的DNA定量。這是DNA定量技術的一次飛躍。

  根據終得到的數據不同,定量PCR可以分為相對定量和定量兩種。典型的相對定量如比較經過不同方式處理的兩個樣本中基因表達水平的高低變化，得到的結果是百分比；

  定量則需要使用標準曲線確定樣本中基因的拷貝數或濃度。根據所使用的技術不同，熒光定量PCR又可以分為TaqMan探針和SYBRGreenI熒光染料兩種方法。比較而言，探針雜交技術在原理上更為嚴格，所得數據更為；熒光染料技術則成本更為低廉，實驗設計更為簡便。在選擇實驗方案時要根據實驗目的和對數據精度的要求來決定。

定量實驗與定性實驗大的不同，是要考慮統計學要求并對數據進行嚴格的校正，以消除偶然誤差。因此重復實驗和設立內對照非常重要。由于各種各樣的客觀原因，這一點在實踐中往往被輕視或忽視，需要著重強調。當然，與定性實驗一樣，定量PCR也要設立陰性和陽性對照，以監控試劑和實驗操作方面可能出現的問題。

 1為什么終點定量不準確？

  我們都知道理論上PCR是一個指數增長的過程，但是實際的PCR擴增曲線并不是標準的指數曲線，而是S形曲線。這是因為隨著PCR循環的增多，擴增規模迅速增大，Taq酶、dNTP、引物，甚至DNA模板等各種PCR要素逐漸不敷需求，PCR的效率越來越低，產物增長的速度就逐漸減緩。當所有的Taq酶都被飽和以后，PCR就進入了平臺期。由于各種環境因素的復雜相互作用，不同的PCR反應體系進入平臺期的時機和平臺期的髙低都有很大變化，難以控制。所以，即使是重復實驗，各種條件基本一致，后得到的DNA拷貝數也是*不一樣的，波動很大。

  傳統的定量方法，如溴乙錠染色或放射性核素摻入標記后的光密度掃描等，測定的都是PCR的終產物，而不是起始DNA拷貝數。由于PCR的終產物量與起始模板量之間沒有線性關系，所以根據終的PCR產物量不能計算出起始DNA拷貝數。

  對于絕大多數實驗，比如甲肝的診斷、藥物療效的監測等，需要測定的都是PCR放大之前標本中的DNA原始拷貝數，經過PCR擴増以后的DNA拷貝數已經不能反映真shiqing況。在這種情況下，就不能采用終點定量，而要根據CT值確定DNA起始拷貝的數量。

  2 為什么CT值與起始模板拷貝數成線性關系？

  CT值的定義是PCR擴增過程中,熒光信號開始由本底進入指數增長階段的拐點所對應的循環次數。從圖1的重復實驗中可以直觀地看到，盡管平臺期DNA拷貝數波動很大,CT值卻是相對固定的。如果用不同濃度的DNA作PCR,可以看出DNA濃度越高,CT值越小。DNA濃度每增加1倍,CT值減小1個循環。CT值與模板DNA的起始拷貝數成反比。

  這一結論可以從數學上嚴格證明。為使表達式簡便,以下推導忽略PCR效率等細節。如果考慮這些因素,可以在方程上增加修正項。這些修正項的增加并不改變方程的線性性質。

  —般地，我們有Rn=RB+X0(1+EX)nRS,也就是說第n次PCR循環時的熒光信號強度(Rn)等于背景信號強度(RB)加上每個分子的熒光強度(即單位熒光強度,RS)與分子數目的乘積。當循環次數n=CT時，則有RT=RB+X0(1+EX)CTRS。兩邊取對數，得log(RT-RB)=logXO+CTIog(1+Ex)+logRs。整理此式,CTIog(1+Ex)=-logXO+log(RT-RB)-logRs。

  所以對于每一個特定的PCR反應來說，EX、RT、RB和RS都是常數，所以CT值與logX0成反比，也就是說，CT值與起始模板拷貝數（X0）的對數成反比，起始DNA濃度每增加1倍，CT值減小1個循環。根據CT值的定量是和嚴格的，而傳統的終點定量則比較粗放。

  如果讀者有興趣的話，也可以假設PCR的效率（即Ex）為100%，從上式推算出定量PCR標準曲線的zuijia斜率和CT值的zuijia范圍。

  3 怎樣確定CT值？

  實驗操作中，CT值定義為在基線上方產生可檢測到的統計學上顯著的熒光發射時所對應的PCR循環次數（圖2）。“基線上方”也就是閾值高度的量化定義是基線范圍內熒光信號強度標準偏差的10倍。閾值所在的橫線與PCR擴增曲線的交點所指的PCR循環次數就是CT值。基線范圍的定義是從第3個循環起到CT值前3個循環止，其終點要根據每次實驗的具體數據調整，一般取第3到第15個循環之間。早于3個循環時，熒光信號很弱，扣除背景后的校正信號往往波動比較大，不是真正的基線高度;而在CT值前3個循環之內，大多數情況下熒光信號已經開始增強，超過了基線高度，都不宜當作基線來處理。

   顯然,CT值取決于閾值，閾值取決于基線,基線取決于實驗的質量,CT值是一個*客觀的參數。CT值越小，模板DNA的起始拷貝數越多;CT值越大，模板DNA的起始拷貝數越少。正常的CT值范圍在18-30之間，過大和過小都將影響實驗數據的精度。

  4 熒光信號和定量數據的歸一化

  雖然大多數定量PCR儀都會自動扣除本底,但是仍然需要注意熒光信號強度和定量數據的歸一化校正,以便不同樣本之間的實驗數據可以嚴格地相互比較。

  由于加樣操作的誤差、離心管透光性能的差異、熒光激發效率的差異等偶然誤差不可避免，因此儀器收集到的原始信號必須進行歸一化校正,以消除這些因素對定量結果的影響。這種校正可以通過在反應體系中添加額外的熒光染料來實現,一般采用紅色ROX熒光，稱為陽性參比信號。ROX在反應緩沖液中的濃度是固定的,因此其信號的強度與反應體系的總體積和總的熒光激發效率正相關。目標基因和對照基因的信號除以陽性參比信號以后，即Rn=R/RROX，就可以在同樣的起點上進行比較和各種計算。

  ROX校正可以提高定量數據的精度和重現性，減少孔間差異（圖3）。

  歸一后的熒光信號再扣除本底,就得到DRn:DRn=Rn,樣本-Rn,空白。DRn是后構建PCR實時擴增曲線的縱坐標。

  無論定量還是相對定量，在得到實驗結果后,還要考慮數據之間的可比性問題。在實驗操作中，取樣都是以體積或重量為單位的，但是同樣體積或重量的樣本所來源的細胞數目并不一樣，所以拷貝/UL或拷貝/ng的定量數據相互之間實際上并不可比。只有將這些數據歸一到以拷貝/細胞或拷貝/基因組為單位后，才可進行嚴格意義上的比較。

  這種校正可以通過適當的參比來完成。參比一般選用b-actin、GAPDH、rRNA基因等管家基因。由于它們在細胞中的表達量或在基因組中的拷貝數是恒定的,受環境因素影響較小，其定量結果代表了樣本中所含細胞或基因組的數量。校正方法為:[DNA]樣本/[DNA]IPC,或者DCT=CT樣本-CTJPC。因為CT值與起始DNA拷貝數的對數是反比關系，可以證明，這兩種計算方法在數學上是等價的。

  為了減少誤差，目標基因和參比基因zuihao在同一反應管內同時進行定量測定,所以這種對照稱為陽性內對照(InternalPositiveControl,IPC)o要進行IPC歸一化校正，定量PCR儀必須具備多色檢測能力,zuihao是4色。否則，目標基因和參比基因只能分兩管作定量，就不成其為“內”標了。

  5 污染的預防和熱啟動

  為保證定量的準確性，要預防非特異性PCR擴增和污染。常用的措施有使用UNG酶(UracH-N-Glycosylase)和熱啟動。UNG酶的作用原理是降解含有dU的雙鏈或單鏈DNA。它在50°C激活,95°C滅活。由于商用PCR試劑盒均以dUTP取代dTTP,所以PCR產物都是含有dU的DNA鏈。在定量PCR開始前增加50°C的保溫步驟,UNG酶即可將已有的PCR產物降解破壞，防止可能造成的污染。

  普通的Taq酶即使在室溫下也有一定的活性，如果不采取措施,在加入PCR試劑的過程中、正式PCR開始前就會完成少量PCR擴增，增加了背景，影響定量精度。而jinpaiTaq酶經過特殊修飾，常溫下其活性部位被封閉，沒有活性;只有經過95°C10min的熱啟動以后，封閉被解除，才能開始DNA鏈延伸，這樣就大限度地減少了雜訊的生成。

  6 標準曲線、重復實驗和陰性、陽性對照

  定量實驗,誤差是不可避免的。設立重復實驗,對數據進行統計處理，可以將誤差降低到小。所以定量實驗的每個樣本至少要重復3次以上，嚴格的定量更應當重復6~8次,以滿足小樣本統計的要求。

  如果作定量，則標準曲線需要在5個點以上。標準曲線使用的標準品是濃度已知的DNA樣本,可以自己制備，也可以購買商品化的試劑盒。其PCR反應條件應當與未知樣本的一致，以便在同反應板上同時定量。

  陰性對照中不加模板DNA，而以水或緩沖液代替，用于檢驗是否存在PCR污染。陽性對照則用于檢驗PCR試劑和實驗操作上可能出現的問題。如果實驗中設立了IPC，則IPC既可以用來校正數據，也可以起到陽性對照的作用。

  7 TaqMan探針技術原理

  TaqMan探針法是高度特異的定量PCR技術，其核心是利用Taq酶的：3'—5'外切核酸酶活性，切斷探針，產生熒光信號。由于探針與模板是特異性結合，所以熒光信號的強弱就代表了模板的數量。

  在TaqMan探針法的定量PCR反應體系中，包括一對PCR引物和一條探針。探針只與模板特異性地結合，其結合位點在兩條引物之間。探針的5'端標記有報告基團(Reporter，R)，如FAM、VIC等，3'端標記有熒光淬滅基團(Quencher,Q)，如TAMRA等。當探針完整的時候，報告基團所發射的熒光能量被淬滅基團吸收，儀器檢測不到信號。隨著PCR的進行，Taq酶在鏈延伸過程中遇到與模板結合的探針，其3'—5'外切核酸酶活性就會將探針切斷，報告基團遠離淬滅基團，其能量不能被吸收，即產生熒光信號（圖4）。所以，每經過一個PCR循環，熒光信號也和目的片段一樣，有一個同步指數增長的過程。信號的強度就代表了模板DNA的拷貝數。TaqMan探針根據其:3'端標記的熒光淬滅基團的不同分為兩種:普通的TaqMan探針和TaqManM探針。MGB探針的淬滅基團采用非熒光淬滅基團(Non-FluorescentQuencher),本身不產生熒光，可以大大降低本底信號的強度。同時探針上還連接有MGB(MinorGrooveBinder)修飾基團(圖5),可以將探針的Tm值提高10°C左右。因此為了獲得同樣的Tm值，MGB探針可以比普通TaqMan探針設計得更短,既降低了合成成本，也使得探針設計的成功率大為提高。因為在模板的DNA堿基組成不理想的情況下，短的探針比長的更容易設計。實驗證明TaqManMGB探針對于富含A/T的模板可以區分得更為理想。