【概述】

近年來基因毒性雜質成為人們關注的焦點，甲磺酸酯、苯甲磺酸等磺酸類物質與微量的低級醇在合成反應中生成烷基磺酸如甲磺酸甲酯（MMS）、甲磺酸乙酯（EMS）、異丙基甲磺酸酯（IMS）、正丁基甲磺酸酯（NBMS），以及芳基磺酸酯如苯磺酸甲酯（MBS）、苯磺酸乙酯（EBS）、對甲苯磺酸酯（MP-TS），這些物質可與DNA發(fā)生烷基化反應，從而可能成為引發(fā)癌癥的誘因，因此控制藥物中該類雜質的毒理學關注閾值（TTC）水平非常重要，歐洲醫(yī)藥評價署（EMEA）發(fā)布了關于基因毒性雜質的大攝取量為1.5μg/d。這些潛在基因毒性的存在引起管理機構的高度重視]，為防止奈非那韋事件的發(fā)生，EMEA首先實施詳細指南控制雜質限度，美國食品和藥物管理局（FDA）隨后頒布指南草案，藥品注冊協(xié)調會議（ICH）也對基因毒性雜質做出限度規(guī)定，《歐洲藥典》增補版7.3明確指出采用衍生化法檢測藥物中MMS、EMS、IMS（2.5.38）。本文簡要介紹了近年來磺酸酯類雜質檢測方法的研究進展，探討了不同檢測方法的特點及不足；同時說明了雜質產生條件和避免該類雜質產生的具體措施，從而有效地控制雜質限度。

【實驗/設備條件】

表1.儀器參數設置

表2.分析物保留時間及定性定量離子

【實驗/操作方法】

溶液配制

標準溶液：取本品30 mg溶于10mL甲苯溶液中，取50μL置于容量瓶中采用80%乙腈水溶液稀釋至25mL，做為標準儲備液A。

準確稱取60g NaI+30 mg硫代硫酸鈉溶于50mL水中，做為衍生化試劑B。

將A稀釋至不同濃度的甲基磺酸酯1mL待用。

取以上0.5 mL甲基磺酸酯待用液+0.5mL衍生化試劑B于20mL頂空瓶中，待分析。

樣品的前處理

稱取某樣品50 mg，溶于0.5 mL 80%乙腈水溶液，加入0.5mLNaI溶液于頂空瓶中，待上機分析。

【實驗結果/結論】

頂空條件的選擇

本實驗選取80%乙腈水溶液做溶劑，可將待分析藥品*溶解，溶劑中含大量有機溶劑因此頂空溫度不易過高，同時隨著樣品平衡溫度的升高，進入氣相的有機物的量增加，從而可以提高分析的靈敏度，但當孵化溫度過高時，對分析目標物碘代烷的靈敏度有影響，從而降低氣相中目標化合物的相對濃度，本實驗中主要考察了40℃、60℃、80℃的平衡溫度對靈敏度的影響，試驗結果表明選擇平衡溫度80℃時目標化合物的靈敏度大，更適宜分析。實驗中傳輸線溫度選擇110℃以保證沒有水氣帶入色譜柱，影響分析效果。

當孵化時間增長分析物在水相和氣相兩相中的分配系數越小，當孵化時間達到一定時間分析物在兩相間達到大的分配，此時為分析時間，本實驗中考察了10 min，20 min，30 min，40 min，50 min，對孵化效率的影響，實驗終結果表明，當孵化時間為20 min時效率高。如下圖為不同孵化時間下孵化效率的比較圖。

圖1. 15μg/L甲基磺酸酯衍生后在不同膜厚Wax色譜柱上的分離情況

色譜柱的選擇

參考歐洲藥典8.0中對藥品中甲基磺酸酯的分析測定方法，符合藥品中基因毒性物質*。本方法采用NaI衍生法將甲基磺酸酯衍生為碘jia烷、碘乙烷、碘異丙烷，通過頂空法進行分析測定。分析的目標化合物碘jia烷、碘乙烷、碘異丙烷為極性低沸點化合物，因此采用極性色譜柱，本方法中考察了Tg-Wax 30 m×0.25μm×0.25 mm和Tg-Wax 30m×0.5μm×0.25 mm兩種不同膜后色譜柱，實驗結果發(fā)現(xiàn)，當選擇膜厚為0.25μm的色譜柱時，由于衍生產物沸點低，在色譜柱上保留能力較小，需將初始溫度降到30℃低溫，此時色譜峰形較差，有托尾現(xiàn)象。

當選擇0.5μm色譜柱時，色譜峰拖尾得到改善，同時出峰時間推后，可將初始溫度升至35℃。如下圖為兩種色譜柱下分析物的色譜圖。

標準品色譜圖及樣品加標色譜

甲基磺酸酯為藥物生產中的副產物，本方法選擇某樣品測定，發(fā)現(xiàn)其中含有甲基甲磺酸酯、甲基異丙基磺酸酯，某藥品中無其它物質對所分析物質干擾，如圖2為某樣品及其加標色譜圖。其中下圖為樣品加標色譜圖。

圖2.圖為加標1.5μg/g濃度樣品加標、樣品色譜圖，其中2.01為甲基磺酸甲酯，2.54為甲基磺酸乙酯，2.82為甲基磺酸異丙酯

線性、檢出限及RSD

配制濃度分別為：1.0、5.0、15.0、75.0、150μg/L的校準溶液，采用上述方法分別進樣分析，考察各組分在1.0-150μg/L濃度范圍內的線性。實驗結果表明3種組分在1.0-150μg/L線性關系良好，線性相關系數均大于0.999（見表3）。

對某樣品添加混合標準溶液（加標濃度為0.02μg/g、1.5μg/g），考察三種甲基磺酸酯的加標回收情況。實驗結果表明各組分的加標回收率均在85.0-103%之間，符合日常分析檢測的要求。對0.02、1.5μg/g加標水平平行測定6次，平均RSD值在5.2-7.3%，符合穩(wěn)定性要求。

同時以三倍信噪比計算各組分檢出限，各組分儀器檢出限在0.2-1.0μg/L（見表3）。

表3.線性、檢出限及RSD數據（n=3）

結論

本實驗采用賽默飛世爾科技Triplus 300頂空自動進樣器結合1300GC配ISQ質譜檢測器分析藥品中的3種基因毒性物質——甲基磺酸酯，樣品通過衍生法采用頂空進樣方式，方法準確，靈敏度高，滿足檢測要求。

【儀器/耗材清單】

儀器：Trace 1310-ISQ SSL進樣口 Triplus-300頂空自動進樣器

色譜柱：TG-Wax MS, 30 m, 0.25 mm, 0.5μm