fff簡介分子之間的能量轉(zhuǎn)移大多是由輻射導致的。然而當不同熒光物質(zhì)非常靠近時（<10nm），會發(fā)生共振能量轉(zhuǎn)移（RET）。熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）是一種的型的 RET現(xiàn)象。

圖1 所示在 FRET 中，使用強光照射以激發(fā)供體能量，處于激發(fā)態(tài)的供體將一部分或全部能量轉(zhuǎn)移給

受體，受體被激發(fā)。如果受體熒光量子產(chǎn)率為零，則發(fā)生能量轉(zhuǎn)移熒光熄滅；如果受體也是一種熒光發(fā)射

體，則呈現(xiàn)出受體的熒光。光照下很多熒光物質(zhì)會逐漸失去其熒光特性，這種現(xiàn)象被稱為光漂白。為了提高靈敏度，近期生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移（BRET）得到了廣泛應(yīng)用¹。BRET使用生物發(fā)光物質(zhì)代替了熒光供體。由于BRET不在需要直射光線以激發(fā)供體，不存在放射性的能量轉(zhuǎn)移，所以避免了對樣品的損害（如圖2）。熒光素酶是一種螢火蟲體內(nèi)的生物發(fā)光酶，被廣泛用于 BRET研究²。本實驗中，選擇Luc8（海腎熒光

素酶）作為供體（圖3），該物質(zhì)由海腎（Renillareinformis）基因突變而來。如圖4所示，Luc8 的生物

熒光峰值接近480nm。

圖2：BRET示意圖

圖 3：海腎（左）和Luc8蛋白結(jié)構(gòu)（右）

圖 4：Luc8的發(fā)射光譜右）

本實驗中，使用了四種類型的量子點（605、655、705和800）：它們具有高量子產(chǎn)率，并適用于多種熒光波長（圖5）。這些量子點在較大的波長范圍內(nèi)都有吸收，但是在605、655、705和800nm時發(fā)出的熒光較強。

圖 5：量子點的結(jié)構(gòu)（左）和熒光（右）

發(fā)光強度相對于強光直射產(chǎn)生的熒光強度較弱，同時使用微量比色皿獲得的光量較小。為了在測量 BRET時能夠更加地收集光，本實驗使用了發(fā)光微量池支架，該配件可zui大程度減少微量池與發(fā)射透鏡之間的距離（圖6）。

試劑和儀器

1.Lumina熒光分光光度計

2.發(fā)光微量池支架

3.PBS緩沖液0.1M（pH 7.4）

 4.Luc8 150 M

5.量子點605、655、705、800 8 M（Invitrogen）

6.腔腸素H 1 g/ l 甲醇溶液（Promega）

7.NiCl2 100 M 蒸餾水溶液（Sigma Aldrich）

8.10 l 微量離心管 

9.45 l 熒光微量池

10.吸液管和吸液頭

11.渦旋混合器

實驗步驟

1.準備4個10 l 微量離心管。

2.在每個離心管內(nèi)填充94 l PBS 緩沖液和 1 l Luc8（供體）。

3.在每個離心管中添加5 l量子點605、655、705、800（受體）。

4.在每個離心管中注入2 l NiCl₂溶液（供體和受體之間的結(jié)合試劑），并在充分混合。

5.將發(fā)光微量池支架安裝到Lumina上，注入樣品并插到支架上。

6.打開Luminous WaveScan 軟件，輸入設(shè)定參數(shù)，點51擊應(yīng)用（Apply）（圖7）。

7.使用吸液管注入2 l腔腸素H，迅速合攏測試艙蓋，點擊開始按鈕。

8.應(yīng)用基線校正功能對測得的光譜進行校正。單擊基線校正（Baseline Correction）圖標，使用具有zui低生物發(fā)光強度的波長進行基線校正（圖8）。

9.根據(jù)Luc8峰值對光譜進行標準化校正，比較量子點峰值。為了標準化，計算各個轉(zhuǎn)換標量，使得所有Luc8峰值強度相等。然后單擊標量計算器（Scalar Calculator）圖標，通過乘以轉(zhuǎn)換標量對其進行標準化轉(zhuǎn)換（圖9）。

儀器參數(shù)

圖 7：波長掃描測量條件

圖 8：基線校正窗口

實驗結(jié)果

從測得的光譜上，可以觀察到BRET現(xiàn)象，Luc8與各量子點發(fā)生了生物發(fā)光能量轉(zhuǎn)移（圖10）。由于多重量子點結(jié)合可在單個波長條件下產(chǎn)生多種波長，因此使用量子點的BRET對分子診斷和成像領(lǐng)域均有很大助。BRET 能量轉(zhuǎn)移的效率的因素有：（1）供體和受體之間的間隔距離；（2）供體發(fā)射和受體激發(fā)光譜的重疊。通過比較使用Luc8峰值進行標準化校正的光譜，我們可以證實量子點665-Luc8結(jié)合物在多個結(jié)合物中產(chǎn)生的BRET效率zui高。

實驗結(jié)論

Thermo Fisher公司的Lumina熒光分光光度計和發(fā)光微量池架配件有助于檢查BRET，其產(chǎn)生的噪音要小于FRET。此外，實驗證明根據(jù)量子點發(fā)射波長的不同，BRET現(xiàn)象可應(yīng)用于較廣的波長范圍。