簡介

熒光量子產(chǎn)率是影響熒光基團熒光壽命的一個重要因素。 熒光量子產(chǎn)率是物質(zhì)發(fā)射熒光的總能量與吸收能量的比值。_Q = photons_em photons_abs量子產(chǎn)率的測定方法分為相對法和法兩種。“絕對”量子產(chǎn)率的測量需要更加復雜的儀器，而確定熒光的“相對”量子產(chǎn)率則較為簡單。相對量子產(chǎn)率測量又分為兩種方法：“一點”法：對于稀溶液，熒光強度與激發(fā)光強度以及熒光量子產(chǎn)率之間有如下關系：F =KIAφ，其中F是熒光強度，K是儀器常數(shù)。激發(fā)光強度，c樣品濃度，l吸收池光徑，ε樣品吸收系數(shù)，φ量子產(chǎn)率。這里clε可用光密度A表示。F=KI₀Aφ。將兩個溶液的熒光強度進行比較：F₁/F₂=K₁I₀₁A₁φ₁/ K₂I₀₂A₂φ₂若兩者使用相同的裝置和測試條件，則F₁/F₂= A₁φ₁/A₂φ₂,即φ₁/φ₂= F₁A₂ / A₁F₂分別測定待測熒光試樣和已知量子產(chǎn)率的參比熒光標準物溶液的積分熒光強度（即熒光光譜所包括的積）以及對一相同激發(fā)波長的入射光的吸光度（使用紫外可見光度計），帶入上述公式即可求得待測樣品量子產(chǎn)率。運用此公式時一般要求吸光度低于0.1（zui好0.05）。第二種就是威廉姆斯等人的“比較法”，該方法使用特征明確的熒光量子產(chǎn)率已知的參照物，選取4-6組濃度，吸光度在0.1-0.01之間逐漸遞減（當然0.05-0.01更好），每一個濃度對應測量一個熒光積分，然后算出斜率，兩個物質(zhì)的斜率再相比得出熒光量子產(chǎn)率。在該實驗中，采用了比較法，而通過與參照物羅丹明6G（其熒光量子產(chǎn)率為0.95）比較，來確定了羅丹明B的熒光量子產(chǎn)率。

試劑和儀器

1.羅丹明B，羅丹明6G：通常用作熒光分析時檢測DNA、RNA和蛋白質(zhì)的試劑。

2. 乙醇

3.Evolution201紫外可見分光光度計

4.Lumina熒光分光計

5.Luminous軟件軟件

6.熒光比色皿(光束路徑長度為10 mm)。

實驗步驟

1.羅丹明B和羅丹明6G各制備4至5個樣品，在激發(fā)波長為535 nm時具有不同的吸光度（0.01-0.1）。

2.固定激發(fā)波長為535nm，測量制備的樣品熒光。

3.計算全光譜熒光強度（即熒光光譜的面積）

4.繪制一張全光譜熒光強度對比吸光度的圖。

5.計算熒光量子產(chǎn)率

儀器參數(shù)

掃描模式：發(fā)射 激發(fā)狹縫：2.5 nm

數(shù)據(jù)模式：熒光 發(fā)射狹縫：2.5 nm

重復次數(shù)：1 激發(fā)光濾鏡：空氣

重復間隔：1 激發(fā)光濾鏡：空氣

PMT電壓：700 V 激發(fā)波：535 nm

掃描速度：300 nm/min 發(fā)射開始：500 nm

積分時間：20 ms 發(fā)射結(jié)束：700 nm

應答時間：0.1 s

實驗結(jié)果

圖3.是羅丹明6G與羅丹明B的吸光度和熒光光譜。熒光光譜的面積可利用圖4中面積計算方式計算得出。

圖3：羅丹明6G（上）與羅丹明B（下）的吸光度（左）和熒光（右）光譜。

圖4熒光光譜面積

表1：吸光度對比熒光光譜面積

利用以下公式計算量子產(chǎn)率：Grad   n^2 Q = ^Q R  Grad_R    n_R²

其中，Grad是從全光譜熒光強度與吸光度圖中獲得的線性擬合梯度。n是溶劑的折光率，下標R是指已知量子產(chǎn)率的參考熒光團。如果在參照物和未知樣品中均采用乙醇作為溶劑，(n²/n²R)將為1，因此熒光量子產(chǎn)率(Q)只有在計算Grad之后才能得出。實驗得出的吸光度對比熒光面積圖以及線性擬合的結(jié)果如圖5所示。

圖5. 吸光度對比熒光面積

在公式中插入Q值0.95（以羅丹明6G的熒光量子產(chǎn)率作為參考），然后計算如下

zui終，得出的羅丹明B的熒光量子產(chǎn)率為0.69，非常接近文獻量子產(chǎn)率 0.7。

一點法對比梯度法

一點法用于確定熒光量子產(chǎn)率，其優(yōu)點是能比梯度法更快獲得結(jié)果。利用以下公式計算未知樣品的量子產(chǎn)

率：an style="mso-spacerun:'yes';font-family:'Times New Roman';font-size:10.5000pt;" >0.95

其中，Q是熒光量子產(chǎn)率，I是全光譜強度，n是溶劑的折光率，OD是光密度。下標R是指已知量子產(chǎn)率的參考熒光團。

通過比較，比較法準確性優(yōu)于單點法測試。