1. 感染預實驗

以 24 孔培養板為例，同時進行目的細胞和工具細胞的感染預實驗。工具細胞可選擇 293T（人胚腎上皮細胞）、H1299（人肺癌細胞）或其它細胞。實驗材料：培養基、24 孔培養板，移液槍，槍頭， EP 管，細胞計數板、冰盒、廢液缸等。（根據目的細胞情況，可酌情使用 Polybrene）

Day1：
準備細胞：培養細胞至對數生長期，細胞以胰酶消化計數后，用細胞計數測出細胞密度，每孔接種 5×104 個細胞，添加細胞培養液至 500µL。通常情況下，該接種量的 H1299 或 293T 細胞在感染后第 3 天可生長至 80%-90% 融合度。（接種目的細胞時，請根據細胞的實際生長速度調整接種量，使目的細胞感染后第 3 天生長至 80%-90% 融合度）

Day2：
（1）準備慢病毒顆粒：計算所需慢病毒顆粒的量，將凍存在 -80℃ 的慢病毒顆粒取出，冰浴融化；
（2）感染目的細胞：從培養箱中拿出細胞，置于顯微鏡下觀察細胞生長狀態及細胞融合度；如細胞狀態較好，則開始實驗：
A. 用移液槍小心吸去 24 孔板中的舊培養液，加入新的*培養液；
B. 在細胞中分別加入計算好的慢病毒顆粒液，將培養板平置于工作臺上，以劃 8 字的方式輕柔混勻；
C. 混勻后，細胞培養板置于 37℃、5% CO2 培養箱，過夜培養。

Day3：
更換培養液：感染 12-16 小時后，吸出含慢病毒顆粒的培養液，重新向培養板添加含 5% 滅活 FBS（胎牛血清）的培養液，繼續培養。（目的細胞需要調整感染時長，部分細胞不可感染超過 12 小時。）

Day4：
繼續培養細胞，觀察細胞狀態是否有異常。

Day5：
觀察（評估）慢病毒顆粒感染效率：蓋緊 24 孔培養板，使用 70% 乙醇清理培養板外壁，在倒置熒光顯微鏡觀察熒光，拍照并估計慢病毒顆粒對細胞的感染效率。（如果慢病毒顆粒攜帶的基因表達所需的時間較長，熒光表達所需時間也較長，建議感染 72、96 小時后觀測熒光表達。）

根據熒光情況，可以初步從 MOI 梯度摸索實驗中，找出目的細胞的 MOI 值。
 

圖 1. H1299 細胞的 MOI 梯度摸索結果示例
 

示例中使用的慢病毒顆粒是 LPP-eGFP-Lv105（滴度 1×10 8TU/mL），曝光時間 1s，顯微倍數 100×。從上圖可見第 2 組細胞的感染效率已達到 90%。由于慢病毒顆粒對細胞有一定毒性，當 MOI 值過高時，繼續添加慢病毒顆粒，感染效率沒有明顯增加，且細胞狀態容易變差、皺縮甚至死亡。

熒光報告基因和目的基因的相對表達并不總是成等比關系的。在有的情況下，即使熒光報告基因表達較低或無表達，目的基因依然能夠表達；反之亦然。所以在觀察熒光效果后，建議使用 qRT-PCR 作進一步鑒定。
 

圖 2. 293T 細胞的 MOI 梯度摸索結果示例
 

示例中使用的慢病毒顆粒是 LPP-eGFP-Lv105（滴度 1×108TU/mL），曝光時間 0.6s，顯微倍數 100×。從上圖可見第 2 組細胞的感染效率已達到 80%。由于慢病毒顆粒對細胞有一定毒性，當 MOI 值過高時，繼續添加慢病毒顆粒，感染效率沒有明顯增加，且細胞狀態容易變差、皺縮甚至死亡。

2. 摸索細胞的zui適藥物篩選濃度

細胞的種類與狀態均會影響慢病毒顆粒轉導效率，部分細胞可能與慢病毒顆粒有相互抵抗的現象，導致感染效率低。當您在感染后 72、96 小時后發現感染效果仍不理想，建議對感染后的細胞進行藥物篩選（藥篩），以收集較多感染成功的細胞。

慢病毒顆粒攜帶的基因整合到目的細胞基因組是隨機發生的非同源性重組，當抗性基因表達時，目的基因不一定也能表達，在進行藥篩處理后，還要以 qRT-PCR 作進一步鑒定。

在進行正式的抗生素篩選前，建議您先對空白細胞的zui小致死濃度進行摸索、優化。
 

表 4. 抗生素篩選細胞的相關參考值

以 293T 細胞+Puromycin 為例，從相關文獻查得 Puromycin 對 293T 細胞的zui小致死濃度為 2 µg/mL。在 2 µg/mL 附件多設置幾個濃度梯度，可以得出較的的篩選濃度。

（1）準備 24 孔培養板，按每孔 1-5×104 細胞數 (約等于 20%-35% 融合度) 接種 293T 空白細胞，對其中 6 個孔進行鋪板；

（2）一般 Puromycin 母液的濃度是 10 mg/mL，用細胞培養基將 Puromycin 母液稀釋 1000 倍，可獲得終濃度為 10 µg/mL 的 Puromycin 稀釋液；

（3）按表 5 所示，每孔添加相應的細胞培養基和 Puromycin；

（4）24 孔培養板置于 37℃、5% CO2 培養箱，培養過夜；

（5）按表 4 的藥篩時間和觀察時間建議，定期在熒光顯微鏡下觀察細胞狀態。
當空白細胞剛好能全部死亡時，該濃度的抗生素可作為zui適藥篩濃度。
 

表 5. 藥物篩選濃度梯度參考（Puromycin）

 

* 表格中使用的 Puromycin 濃度為 10 µg/mL，是由 10 mg/mL 的 Puromycin 母液以細胞培養液稀釋 1000 倍所得。

注：以上表格的設置僅供參考。通常即使細胞一樣，由于培養的條件和傳代次數不一樣，篩選濃度亦不一樣。可根據試驗結果進行更進一步的細化濃度梯度設置。 如果藥篩過程中細胞量較少，為保持細胞的數一定，一般不換液，只有在穩轉株藥篩過程中，根據細胞生長速度，3-4 天換液一次。

如果目的細胞較難感染，一次感染不能達到預期效果時，在感染 3 天后可對目的細胞進行藥篩處理，獲得較多被感染的細胞，如以下例子所示：
 

圖 3. 人食管癌細胞 CE-81T（貼壁細胞）的藥篩前后效果對比
 

圖 4. 人骨肉瘤細胞 Hos（貼壁細胞）的藥篩前后效果對比
 

圖 5. 人白血病 K562（懸浮細胞）的藥篩前后效果對比
 

附：細胞融合度參考
 

圖 6. 293T 細胞在不同融合度的明視野效果（放大倍數：100×）

3. 實驗體系的放大和正式實驗

根據預實驗結果，放大慢病毒顆粒細胞感染實驗，實施正式實驗。

通過慢病毒顆粒感染細胞的預實驗，我們大致獲得慢病毒顆粒感染目的細胞的優化條件。正式實驗所用的細胞數往往比預實驗多，慢病毒顆粒用量也需要適當放大。放大原則是保持細胞密度一致，按實際細胞數與預實驗細胞數的比例放大培養液體積和慢病毒顆粒用量。有兩種放大方法可供參考：

按底面積放大（適用于貼壁細胞）
當細胞的密度不變時，細胞總數和底面積成正比，且 MOI 不變，所需慢病毒顆粒用量也和底面積成正比。假設預實驗使用 96 孔板（底面積 0.3 cm2），使用 1 μL 慢病毒顆粒（滴度 1×108 TU/mL）可成功感染細胞；如正式實驗使用 6 孔板（底面積 10 cm2），則：
底面積的放大倍數 ≈ 33
正式的慢病毒顆粒用量 = 預實驗用量×33 = 33 μL 慢病毒顆粒（滴度 1×108 TU/mL）
注：請確保細胞均勻、單層分布，不成簇生長。

按培養體積放大（適用于懸浮細胞）
當細胞的密度不變時，細胞總數和感染體積成正比，且 MOI 不變，所需慢病毒顆粒用量也和培養液體積成正比。假設預實驗使用 96 孔板（培養體積 100μL），使用 1 μL 慢病毒（滴度 1×108 TU/mL）可成功感染細胞；如正式實驗使用 6 孔板（培養體積 2 mL），則：
培養體積的放大倍數 = 20
正式的慢病毒顆粒用量 = 預實驗用量×20 = 20 μL 慢病毒顆粒（滴度 1×108 TU/mL）
注：請確保細胞生長狀態良好。