ELISA試劑盒因為具有靈敏度高、特異性強，酶免疫試劑的性質(zhì)比較穩(wěn)定，操作方法簡便快速、無放射性污染以及應用范圍廣等很多優(yōu)點，受到很多科研工作者的喜愛，但是Elisa試劑盒的測定，受很多方面影響，這也是ELISA檢測中的重要部分，下面對其中一個影響方面加以說明。

   抗原：在ELISA中，包被于固相載體表面的抗原或抗體的來源和制備方法對試驗結(jié)果都有影響。包被所用的抗原必須是可溶性的，而且要求是和穩(wěn)定的制劑，純度和免疫原性要高。如果不純，由于抗原中所含雜質(zhì)就會競爭固相載體上的有限位置，降低敏感性和特異性。此外還應考慮到制備包被抗原不應破壞其免疫學活性。經(jīng)試驗證明，適用于其他血清學試驗的抗原并非均適合用于ELISA法。因此，對某一疾病的診斷，必須通過實踐，才能選出適用的抗原。對大多數(shù)傳染病和寄生蟲病的血清學診斷中所用的抗原并非要求十分嚴格，一般能用于補體結(jié)合試驗的可溶性抗原均可用于ELISA，例如超聲波抗原、凍融抗原、細菌的外膜抗原、脂多糖（LPS）、細菌的外毒素以及用表面活性劑(如SDS)所提取的抗原等，在作ELISA時，必須要有1-2種試劑、要求純化，但用表面活性劑提取的抗原在包被前必須透析除去表面活性劑，否則就不易吸附到固相載體上去。此外，對某些抗原必須進行提純，如病毒的組織培養(yǎng)和雞胚培養(yǎng)物以及病毒接種動物的臟器等，它們當中存在著許多非抗原的蛋白質(zhì)，必須設法除去，常用梯度超速離心或親和層析法提純，不經(jīng)提純是不能使用的。在用特異性抗體包被固相載體時也要提純。用抗原或抗體蛋白包被固相載體時選擇的濃度要適當。如濃度太高，則低效價抗體可能測不出來，或包被過量形成多層抗原吸附，故在操作過程中可能脫落從而降低敏感性和可重復性。用zui適稀釋度抗原，包被固相載體不僅經(jīng)濟，而且可以克服前帶現(xiàn)象。那么用多大濃度抗原進行包被zui為合適呢？可通過棋盤滴定法進行測定，但用單項滴定法更為簡便，其方法是將抗原進行一系列稀釋包被微量反應板，再用一定稀釋度的陽性參考血清和陰性參考血清進行孵育后洗滌，再加酶結(jié)合物進行反應，經(jīng)孵育洗滌后，加底物溶液顯色，終止反應后分別測定O.D值，選擇O.D值≥1.0的那個抗原稀釋度為zui適包被濃度。一般總是要選擇那個O.D值稍大于1.0，而不選擇小于1.0的抗原濃度。陰性參考血清O.D值要求<0.1-0.2。也就是要求陽性參考血清和陰性參考血清的O.D值有明顯差別。抗原包被固相載體除濃度外，對時間、溫度、PH均有關系。溫度高（如37℃、45℃、或56℃），包被時間可縮短，溫度低可延長包被時間。但為了方便起見，通常采用4℃包被過夜，可使抗原吸附得更加*且均勻。在用聚苯乙烯或聚乙烯微量反應板或塑料管作固相載體時，在堿性條件下（如0.1mol/L、PH9.6碳酸鹽緩沖液稀釋抗原）4℃包被過夜較為合適。但在某些試驗中，如用LPS或毒素蛋白包被時，用PH 7.2-7.4 PBS稀釋才是滿意的。包被特異蛋白質(zhì)的濃度為1-10ug/ml，而對某些病原微生物抗原以5-20ug/ml較為合適，但均應通過滴定。

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