熒光染料大總結(jié)！

熒光顯微鏡技術(shù)的基本原理是借助熒光劑讓細(xì)胞成分呈現(xiàn)高度具體的可視化效果，比如在目的蛋白后面連一個(gè)通用的熒光蛋白—GFP。在組織樣本中，目的基因無(wú)法進(jìn)行克隆，則需要用免疫熒光染色等其他技術(shù)手段來(lái)觀察目的蛋白。為此，就需要利用抗體，這些抗體連接各種不同的熒光染料，直接或間接地與相應(yīng)的靶結(jié)構(gòu)相結(jié)合。此外，借助熒光染料，熒光顯微鏡技術(shù)不只局限于蛋白質(zhì)，它還可以對(duì)核酸、聚糖等其他結(jié)構(gòu)進(jìn)行染色，即便鈣離子等非生物物質(zhì)也可以檢測(cè)出來(lái)。本文就對(duì)幾種常用的熒光劑進(jìn)行了具體的介紹。

免疫熒光 (IF)

在熒光顯微鏡技術(shù)中，可以通過(guò)兩種方式觀察到你的目的蛋白：利用內(nèi)源熒光信號(hào)，即通過(guò)克隆手段，用遺傳學(xué)方法將熒光蛋白與目的蛋白相連；或利用熒光標(biāo)記的抗體特異性結(jié)合目的蛋白。有些生物學(xué)問(wèn)題采用第二種方法會(huì)更有用或更有必要。比如，組織學(xué)樣品無(wú)法使用熒光蛋白，因?yàn)橥ǔ?lái)說(shuō)，標(biāo)本都是從無(wú)法保存熒光蛋白的生物體中獲取。此外，當(dāng)有一個(gè)有功能的抗體可用時(shí)，免疫熒光法會(huì)比熒光蛋白技術(shù)快很多，因?yàn)楹笳弑仨毾瓤寺∧康幕蛟賹NA轉(zhuǎn)染到適當(dāng)?shù)募?xì)胞中。熒光蛋白的另一項(xiàng)劣勢(shì)在于其本身屬于蛋白質(zhì)。因此，細(xì)胞內(nèi)的這些熒光蛋白具有特定的蛋白質(zhì)特性，其會(huì)導(dǎo)致附著的目的蛋白質(zhì)發(fā)生功能紊亂或出現(xiàn)誤釋的情況。然而，熒光蛋白技術(shù)仍然是觀察活細(xì)胞的方法。

免疫熒光法利用了抗體可以和相應(yīng)抗原特異性結(jié)合的這個(gè)特性，對(duì)此它還有兩種不同的表現(xiàn)形式。zui簡(jiǎn)單的方式是使用可與目的蛋白相結(jié)合的熒光標(biāo)記抗體。這種方法被稱(chēng)為“直接免疫熒光法”。

在很多情況下，我們可以利用兩種不同特性的抗體。*種抗體可以結(jié)合目的蛋白，但其本身并未進(jìn)行熒光標(biāo)記（一抗）。第二種抗體本身就攜帶熒光染料（二抗），并且可以特異性結(jié)合一抗。這種方法被稱(chēng)為“間接免疫熒光法”。這種方法存在諸多優(yōu)勢(shì)。一方面，它會(huì)產(chǎn)生放大效應(yīng)，因?yàn)椴恢灰粋€(gè)二抗可以與一抗相結(jié)合。另一方面，沒(méi)有必要始終用熒光染料標(biāo)記目的蛋白的每個(gè)抗體，但可以使用市售熒光標(biāo)記的二抗。免疫熒光中廣泛使用的熒光染料包括 FITC、TRITC 或一些Alexa Fluor®染料，下文均有提及。

FITC 和 TRITC

異硫氰酸熒光素(FITC) 是一種有機(jī)熒光染料，目前，這種熒光染料仍用于免疫熒光和流式細(xì)胞術(shù)中。在 495/517 nm 處，該染料會(huì)產(chǎn)生激發(fā)/發(fā)射峰值，并可借助異硫氰酸鹽反應(yīng)基團(tuán)與不同抗體結(jié)合，該基團(tuán)可以和蛋白質(zhì)上的氨基、巰基、咪唑、酪氨酰、羰基等基團(tuán)相結(jié)合。而它的基本成分—— 熒光素，其摩爾質(zhì)量為 332 g/mol，常被用作熒光示蹤劑。FITC(389 g/mol) 是用于熒光顯微鏡技術(shù)的*染料，且其被當(dāng)成 Alexa Fluor®488 等后續(xù)熒光染料的發(fā)端。該染料的熒光活性取決于它的大共軛芳香電子系統(tǒng)，而該系統(tǒng)受藍(lán)色光譜中的光所激發(fā)。

經(jīng)常與 FITC 同時(shí)使用的另一種染料是與其相似的TRITC [四甲基羅丹明-5(6)-異硫氰酸]。與 FITC 相反，TRITC 并非熒光素，而是羅丹明家族的衍生物。羅丹明也具有一個(gè)大的共軛芳香電子系統(tǒng)，正是該系統(tǒng)引發(fā)了它們的熒光行為。還有一點(diǎn)與FITC 相反，TRITC (479 g/mol) 由zui大波長(zhǎng)為 550nm的綠色光譜中的光所激發(fā)，它的zui大發(fā)射波長(zhǎng)為 573 nm。與蛋白質(zhì)（例如，抗體）結(jié)合也基于異硫氰酸鹽反應(yīng)基團(tuán)。

雖然 FITC 和 TRITC 仍在使用，但由于它們屬于發(fā)光相對(duì)較弱的熒光染料且它們的優(yōu)勢(shì)僅僅是經(jīng)濟(jì)實(shí)惠，因此，在的顯微鏡技術(shù)中并不推薦。

圖 1：果蠅胚胎發(fā)育，綠色：FITC；紅色：TRITC

青色素

這類(lèi)熒光染料相對(duì)較少，從青色素衍生而來(lái)，也是其名稱(chēng)的由來(lái)：Cy2、Cy3、Cy5 和Cy7。上述所有青色素均可以通過(guò)其反應(yīng)基團(tuán)與核酸或蛋白相連。例如，采用了蛋白標(biāo)記的馬來(lái)酰亞胺基團(tuán)。有趣的是，對(duì)于熒光，Cy5 對(duì)其周邊電子環(huán)境非常敏感，該特征可用于酶測(cè)定。附著蛋白質(zhì)的構(gòu)象改變會(huì)導(dǎo)致熒光發(fā)射產(chǎn)生陽(yáng)性或陰性變化。此外，Cy3 和 Cy5 還可用于 FRET 試驗(yàn)。青色素染料是一種相對(duì)較老的熒光染料，但卻是其他熒光染料在亮度、耐光性、量子產(chǎn)率等方面得以改善的基礎(chǔ)。

Alexa Fluor®染料

Alexa Fluor®染料是帶負(fù)電荷且親水的熒光染料系列，該系列染料囊括范圍較廣，且經(jīng)常用于熒光顯微鏡技術(shù)之中。這些染料的名稱(chēng)是由其Richard Paul Haugland 以他兒子 Alex Haugland 的名字命名的。該產(chǎn)品標(biāo)識(shí)是 Molecular Probes（美國(guó)生命科學(xué)技術(shù)公司 Life Technologies旗下子公司，注：2014年2月Life Technologies被Thermo Fisher收購(gòu)）的商標(biāo)。此外，這些產(chǎn)品標(biāo)識(shí)中也涵蓋了相應(yīng)的激光激發(fā)波長(zhǎng)。例如，應(yīng)用范圍很廣且zui大激發(fā)波長(zhǎng)為 493 nm的Alexa Fluor®488，可由標(biāo)準(zhǔn)的488 nm激光激發(fā)。Alexa Fluor®488的zui大發(fā)射波長(zhǎng)為 519 nm，正是因?yàn)榫邆渖鲜鎏匦裕沟?Alexa Fluor®488與 FITC 的屬性相似。盡管 Alexa Fluor®488是一種熒光素衍生物，但與 FITC 相反，它擁有更佳的穩(wěn)定性和熒光亮度，且 pH 敏感度也更低。所有 Alexa Fluor® 染料（比如，Alexa Fluor®546、Alexa Fluor®633）都是不同基礎(chǔ)熒光物質(zhì)的磺化形式，例如，熒光素、香豆素、青色素或羅丹明，它們的摩爾質(zhì)量在410 至 1400 g/mol 范圍之內(nèi)。

圖 2：小鼠轉(zhuǎn)基因胚胎、肢間體節(jié)，E10.5 小鼠轉(zhuǎn)基因胚胎的 5 個(gè)肢間體節(jié)：EpaxialMyf5 eGFP；GFP-Alexa 488 免疫組化染色；用 Desmin-Cy3 對(duì)胚胎肌肉纖維進(jìn)行染色，用 Hoechst Size 自上而下揭示細(xì)胞核：3.5 mm (a)，800 µm (b)。圖片來(lái)源：Aurélie Jory, CellulesSouches et Développement, Institut Pasteur, Paris,France and Imaging centre of IGBMC, IGBMC。

圖 3：小鼠成纖維細(xì)胞，綠色：F-Actin，F(xiàn)ITC；紅色：Tubulin，Cy5；藍(lán)色：細(xì)胞核，DAPI。圖片來(lái)源：德國(guó)·海德?tīng)柋?middot;馬克斯-普朗克研究所·Günter Giese博士

DNA 染色

在熒光顯微鏡技術(shù)中，不只研究蛋白結(jié)構(gòu)，核酸同樣具有重要的研究意義。有時(shí)候，必須通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞核來(lái)確定細(xì)胞的位置及其數(shù)量。zui常用的一種DNA 染色劑當(dāng)屬 DAPI (4',6-二脒基-2-苯基吲哚) ，其可與DNA 雙螺旋的 A-T 富集區(qū)域相結(jié)合。如果 DAPI 附著到 DNA 上，其熒光強(qiáng)度將比游離狀態(tài)要高。該染色劑受zui大波長(zhǎng)為358 nm的紫外光激發(fā)，其發(fā)射光譜非常寬，在461 nm 處達(dá)到峰值。此外，還可對(duì)弱熒光進(jìn)行 RNA 結(jié)合檢測(cè)。在這種情況下，發(fā)射波長(zhǎng)將轉(zhuǎn)移至 500 nm。有趣的是，DAPI 能夠穿透整個(gè)細(xì)胞膜。因此，它可以用于固定和活細(xì)胞之中。

第二種被廣泛使用的DNA 染色劑就是 Hoechst 染料系列，這些染料原先都是由 Hoechst AG 這家化學(xué)公司生產(chǎn)的。Hoechst 33258、Hoechst 33342以及Hoechst 34580 均為雙苯酰亞胺，可嵌入 A-T 富集區(qū)域，因此，該系列染料很少用到。與 DAPI 相似，這三種染色劑都可受zui大發(fā)射波長(zhǎng)為455 nm的紫外光激發(fā)，而未被結(jié)合的染色劑，其zui大發(fā)射波長(zhǎng)在 510–540 nm 之間。Hoechst 染色劑還具有細(xì)胞滲透性，因此可用于活細(xì)胞或已固定的細(xì)胞中。該染色劑與DAPI 的不同之處在于，它們的毒性較低。

碘化丙啶（Propidium-Iodide，PI）是一種不能透過(guò)細(xì)胞膜的 DNA 染色劑。由于具備上述特性，該染色劑無(wú)法進(jìn)入完整的細(xì)胞中，因此，該染色劑常用于區(qū)分細(xì)胞群中的活細(xì)胞和死細(xì)胞。此外，碘化丙啶還是一種嵌入劑，但對(duì)于不同的堿基并不存在結(jié)合的差異性。該染色劑與核酸結(jié)合后，zui大激發(fā)波長(zhǎng)為538 nm，zui大發(fā)射波長(zhǎng)為 617 nm。未結(jié)合 PI 的zui大激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)和光強(qiáng)會(huì)更低一些。PI 還可結(jié)合 RNA，同時(shí)無(wú)需改變自身的熒光特性。有時(shí)候?yàn)榱藚^(qū)分DNA 和 RNA，有必要使用適當(dāng)?shù)暮怂崦浮?/span>

不需要前期處理，吖啶橙就可以鑒別DNA 與 RNA 。吖啶橙與 DNA 結(jié)合后，zui大激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)為 502 nm/525 nm，而與 RNA 結(jié)合后，zui大激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)為460 nm/650 nm。此外，它還能夠進(jìn)入溶酶體等酸性區(qū)室。在這里，陽(yáng)離子染料被質(zhì)子化。在這種酸性環(huán)境下，吖啶橙由藍(lán)色光譜中的光激發(fā)，但發(fā)射波長(zhǎng)在橙色區(qū)域達(dá)到zui大。由于凋亡細(xì)胞具有大量被吞噬的酸性區(qū)室，因此，吖啶橙常用作此類(lèi)細(xì)胞的標(biāo)記物。

區(qū)室和細(xì)胞器特異性染料

在熒光顯微鏡技術(shù)中，往往要對(duì)溶酶體、核內(nèi)體等細(xì)胞區(qū)室以及線粒體等細(xì)胞器進(jìn)行染色。為此，該部分介紹了一系列可供選擇使用的特異性染料。

觀察線粒體zui常用的方法就是利用 MitoTracker®，它是一種可透過(guò)細(xì)胞的染料，包含輕度巰基化的氯甲基活性部分。正因如此，它可與半胱氨酸殘基的游離硫醇基反應(yīng)，從而與基質(zhì)蛋白實(shí)現(xiàn)共價(jià)結(jié)合。MitoTracker® 有不同的顏色和修飾類(lèi)型（參見(jiàn)表 1），此外，它還是 Molecular Probes 的商標(biāo)。與羅丹明 123 (Rh123) 或 tetramethylrosamine等常規(guī)線粒體特異性染色劑不同，在用固定劑破壞膜電位后，MitoTracker®不會(huì)被洗掉。

依據(jù)線粒體染色劑，還有些染料可以標(biāo)記溶酶體等酸性區(qū)室，這類(lèi)染料被稱(chēng)為L(zhǎng)ysoTracker。它們由連接一個(gè)熒光基團(tuán)的弱堿基團(tuán)組成，具有膜穿透性。zui有可能的情況是，這些堿基因質(zhì)子化作用的影響而對(duì)酸性區(qū)室具有親和性。LysoTracker具有多種不同的顏色可供選擇（參見(jiàn)表 1）。

與溶酶體相似的區(qū)室是釀酒酵母等真菌中的液泡，這種膜密閉空間也是一種酸性環(huán)境。如果要在熒光顯微鏡下觀察上述區(qū)室，則要使用FM 4-64®或FM 5-95®等苯乙烯基染料。

對(duì)于蛋白質(zhì)分泌實(shí)驗(yàn)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng) (ER) 具有重要的研究意義。對(duì)上述區(qū)室進(jìn)行染色的一種典型染料為DiOC6(3)。該染料雖然偏好 ER，但仍會(huì)結(jié)合線粒體等其他細(xì)胞器膜。對(duì)ER 進(jìn)行特異性染色的另一種方法是，使用 ER-Tracker Green 和 Red 等 ER-Tracker，而 ER-Tracker Green 和 Red 是基于 BODIPY 的兩種染料，其與格列本脲（一種磺酰基脲酶）連接，并可與僅存于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的ATP敏感性鉀通道結(jié)合。BODIPY（硼-二吡咯亞甲基，boron-dipyrromethene）是一種幾乎不溶于水的、對(duì)pH 相對(duì)不敏感的染料基團(tuán)，該染料對(duì)蛋白質(zhì)標(biāo)記沒(méi)太大用處，但卻是脂質(zhì)和膜標(biāo)記的良好工具。

對(duì)于與ER相鄰的高爾基體，可以用 NBD C6-ceramide 和BODIPYFL C5-ceramide 等熒光神經(jīng)酰胺類(lèi)似物對(duì)其進(jìn)行標(biāo)記。 上述神經(jīng)酰胺為鞘脂類(lèi)，其在高爾基體中高度富集。

借助基于脂質(zhì)的染料，可以對(duì)脂筏等特異膜區(qū)域進(jìn)行染色。使用 NBD-6Cholestrol或NBP-12 Cholesterol 可以觀察膽固醇富集區(qū)域（Avanti Polar Lipids）。

除了使用特異性非蛋白熒光染料對(duì)細(xì)胞區(qū)室進(jìn)行標(biāo)記之外，還可以借助對(duì)細(xì)胞中不同位置有偏好的蛋白質(zhì)對(duì)目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行染色。這些蛋白質(zhì)可以和熒光染料相連，并可通過(guò)熒光顯微鏡進(jìn)行觀察。運(yùn)用這種方法的一個(gè)實(shí)例是：麥胚凝集素(WGA) 可以與細(xì)胞質(zhì)膜中的唾液酸和N-乙酰葡萄糖胺基特異性結(jié)合，將WGA 與熒光染料偶聯(lián)，這樣我們就可以觀察到細(xì)胞質(zhì)膜了。

圖 4：Pukinje細(xì)胞，小鼠小腦皮質(zhì)三重標(biāo)記的縱側(cè)截面圖。紅色：anti-calbindin-D28k/Cy3；綠色：anti-GFAP/Cy5；藍(lán)色：Hoechst 33258

圖 5：牛肺部?jī)?nèi)皮細(xì)胞。紅色：用 MitoTracker®Red CMXRos 標(biāo)記的線粒體；綠色：用綠色熒光 BODIPY®FLphallacidin 標(biāo)記的纖維狀肌動(dòng)蛋白；藍(lán)色：用 DAPI 標(biāo)記的細(xì)胞核。使用三維盲反褶積可以改善該圖像的質(zhì)量。

離子成像

在有關(guān)神經(jīng)元方面的研究中，觀察基因活性或細(xì)胞運(yùn)動(dòng)等對(duì)于了解細(xì)胞的離子濃度具有重要意義。鈉、鈣、氯或鎂離子對(duì)很多不同的細(xì)胞活動(dòng)都具有較大影響。一般情況下，借助熒光標(biāo)記的螯合劑可將離子困住，螯合劑在結(jié)合相應(yīng)離子后會(huì)改變離子的光譜特性。例如，利用該原理的鈣指示劑fura-2、indo-1、fluo-3、fluo-4和Calcium-Green 等。

對(duì)于鈉離子的檢測(cè)，通常使用 SBFI (sodium-bindingbenzofurzanisophthalate) 或Sodium Green。PBFI(potassium-binding benzofurzanisophthalate) 可以檢測(cè)鉀離子。

有趣的是，還存在以蛋白質(zhì)為主的鈣指示劑，其中一種是基于水母化學(xué)發(fā)光蛋白—水母素。水母素、發(fā)光體腔腸素、分子氧和 Ca2+的相互作用會(huì)釋放藍(lán)光，這是在熒光蛋白質(zhì)的發(fā)現(xiàn)過(guò)程中非常的機(jī)制。

熒光染料及其激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)峰值

上文提到的所有染料在下表中均有統(tǒng)計(jì)。此外，還涵蓋了其他熒光染料及其激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)峰值。