一、概況及發(fā)展歷史

1．原理
在吸收紫外和可見(jiàn)電磁輻射的過(guò)程中，分子受激躍遷至激發(fā)電子態(tài)，大多數(shù)分子將通過(guò)與其它分子的碰撞以熱的方式散發(fā)掉這部分能量，部分分子以光的形式放射出這部分能量，放射光的波長(zhǎng)不同于所吸收輻射的波長(zhǎng)。

后一種過(guò)程稱(chēng)作光致發(fā)光。分子發(fā)光包括熒光、磷光、化學(xué)發(fā)光、生物發(fā)光和散射光譜等。基于化合物的熒光測(cè)量而建立起來(lái)的分析方法稱(chēng)為分子熒光光譜法。

由光源發(fā)出的光通過(guò)切光器使其變成斷續(xù)之光，通過(guò)激發(fā)光單色器變成單色光，此光即為熒光物質(zhì)的激發(fā)光。被測(cè)的熒光物質(zhì)在激發(fā)光照射下所發(fā)出的熒光，經(jīng)過(guò)單色器變成單色熒光后照射于光電倍增管上，由其所發(fā)生的光電流經(jīng)過(guò)放大器放大輸至記錄儀。一個(gè)激發(fā)，一個(gè)發(fā)射，采用雙單色器系統(tǒng)，可分別測(cè)量激發(fā)光譜和熒光光譜。

2．分類(lèi)
熒光光譜儀是測(cè)定材料發(fā)光性能的基本設(shè)備。 通用熒光光譜儀大致可分為3種：
(1) 基本型：在200-800 nm的紫外可見(jiàn)波段的穩(wěn)態(tài)光譜儀。 
(2) 擴(kuò)展型：覆蓋200-1700 nm波段的紫外可見(jiàn)-近紅外穩(wěn)態(tài)光譜儀。 
(3) 綜合型：覆蓋上述兩個(gè)波段，同時(shí)可測(cè)瞬態(tài)光譜的光譜儀。

3．主要用途
（1）熒光激發(fā)光譜和熒光發(fā)射光譜； 
（2）同步熒光（波長(zhǎng)和能量）掃描光譜；
（3）3D（Ex Em Intensity) ；
（4）Time Base和CWA(固定波長(zhǎng)單點(diǎn)測(cè)量）； 
（5）熒光壽命測(cè)量，包括壽命分辨及時(shí)間分辨；
（6）計(jì)算機(jī)采集光譜數(shù)據(jù)和處理數(shù)據(jù)（Datamax和Gram32)。

4．發(fā)展歷史
*次記錄熒光現(xiàn)象的是16世紀(jì)西班牙的內(nèi)科醫(yī)生和植物學(xué)家N.Monardes，1575年他提到在含有一種稱(chēng)為“LignumNephriticum”的木頭切片的水溶液中，呈現(xiàn)了極為可愛(ài)的天藍(lán)色。在17世紀(jì)，Boyle（1626—1691）和Newton（1624—1727）等科學(xué)家再次觀(guān)察到熒光現(xiàn)象。之后熒光就引起了許多科學(xué)家的研究興趣，熒光分析方法也越來(lái)越多的被應(yīng)用到生物和化學(xué)分析當(dāng)中。

當(dāng)然熒光分析方法的發(fā)展，與儀器應(yīng)用的發(fā)展是分不開(kāi)的。總體來(lái)說(shuō)，熒光光譜儀自問(wèn)世以來(lái)經(jīng)過(guò)了三個(gè)階段的發(fā)展過(guò)程：
（1）手動(dòng)式；
（2）自動(dòng)掃描；
（3）微機(jī)化。

19世紀(jì)以前，熒光的觀(guān)察是靠肉眼進(jìn)行的，直到1928年，才由Jette和West提出了*臺(tái)光電熒光計(jì)。光電熒光計(jì)的靈敏度是有限的，1939年Zworykin和Rajchman發(fā)明光電倍增管以后，在增加靈敏度和容許使用分辨率更高的單色器等方面，是一個(gè)非常重要的階段。1943年Dutton和Bailey提出了一種熒光光譜的手工校正步驟，1948年由Studer推出了*臺(tái)自動(dòng)光譜校正裝置，到1952年才出現(xiàn)商品化的校正光譜儀器。 

二、主要部件及功能

熒光光譜儀主要包括光源、激發(fā)單色器、樣品池、熒光單色器及檢測(cè)器等主要部件。

1．光源
早期的熒光分光光度計(jì)，配有能發(fā)生很窄汞線(xiàn)的低壓汞燈。使用高壓汞燈，譜線(xiàn)被加寬，而且也存在高強(qiáng)度的連續(xù)帶。然而，一個(gè)完整的激發(fā)光譜的測(cè)定需一種能發(fā)射從可見(jiàn)到紫外范圍的較高強(qiáng)度的光輻射的燈。氙弧燈能適于此條件，因此，它是目前在熒光分光光度計(jì)中zui廣泛使用的光源。

2．單色器
單色器的作用是把光源發(fā)出的連續(xù)光譜分解成單色光，并能準(zhǔn)確方便地“取出”所需要的某一波長(zhǎng)的光，它是光譜儀的心臟部分。單色器主要由狹縫、色散元件和透鏡系統(tǒng)組成，其中色散元件是關(guān)鍵部件。色散元件是棱鏡和反射光柵或兩者的組合，它能將連續(xù)光譜色散成為單色光。

（1）棱鏡單色器
棱鏡單色器是利用不同波長(zhǎng)的光在棱鏡內(nèi)折射率不同將復(fù)合光色散為單色光的。棱鏡色散作用的大小與棱鏡制作材料及幾何形狀有關(guān)。常用的棱鏡用玻璃或石英制成。可見(jiàn)分光光度計(jì)可以采用玻，它適用于紫外、可見(jiàn)整個(gè)光譜區(qū)。

（2）光柵單色器
光柵作為色散元件具有不少*的優(yōu)點(diǎn)。光柵可定義為一系列等寬、等距離的平行狹縫。光柵的色散原理是以光的衍射現(xiàn)象和干涉現(xiàn)象為基礎(chǔ)的。常用的光柵單色器為反射光柵單色器，它又分為平面反射光柵和凹面反射光柵兩種，其中zui常用的是平面反射光柵。光柵單色器的分辨率比棱鏡單色器分辨率高（可達(dá)±0.2nm），而且它可用的波長(zhǎng)范圍也比棱鏡單色器寬，且入射光80%的能量在一級(jí)光譜中。近年來(lái)，光柵的刻制復(fù)制技術(shù)也在不斷地改進(jìn)，其質(zhì)量也在不斷的提高，因而其應(yīng)用日益廣泛。

（3）狹縫
狹縫是單色器的重要組成部分，直接影響到分辨率。狹縫寬度越小，單色性越好，但光強(qiáng)度也隨之減少。

3．樣品池
熒光儀用的樣品池需用低熒光的材料制成，通常用玻璃和石英材料，形狀以方形和長(zhǎng)方形為宜。

4．檢測(cè)器
主要有硒光電池、光電管和光電倍增管等。目前來(lái)說(shuō)由于熒光的強(qiáng)度較弱，一般以光電倍增管作檢測(cè)器。選擇光電倍增管要考慮響應(yīng)波長(zhǎng)、靈敏度和噪聲水平等。藍(lán)敏管對(duì)蛋白質(zhì)、核酸的測(cè)量適用，而紅敏管則適用于熒光染料檢測(cè)。

三、應(yīng)用

目前熒光分析法已經(jīng)發(fā)展成為一種重要且有效的光譜化學(xué)分析手段。在我國(guó)，50年代初期僅有極少數(shù)的分析化學(xué)工作者從事熒光分析方面的研究工作，但到了70年代后期，熒光分析法已引起國(guó)內(nèi)分析界的廣泛重視，在全國(guó)眾多的分析化學(xué)工作者中，已逐步形成一支從事這一領(lǐng)域工作的隊(duì)伍。

1. 熒光分析特點(diǎn)
（1）熒光分析的主要特點(diǎn)是靈敏度高、選擇性好，熒光分析的靈敏度要比吸收光譜測(cè)量高2-3個(gè)數(shù)量級(jí)。分光光度法通常在 10-7 級(jí) ，而熒光的靈敏度達(dá)10-9。

（2）強(qiáng)選擇性強(qiáng)，熒光物質(zhì)具有兩種特征光譜：激發(fā)光譜和吸收光譜，相對(duì)于分光光度法單一的吸收光譜來(lái)說(shuō)，熒光光譜可根據(jù)激發(fā)光譜和發(fā)射光譜來(lái)鑒定物質(zhì)。 

（3）信息量豐富，能提供熒光物質(zhì)的多種參數(shù)。 

（4）但是熒光分析方法也有其不足之處：①很多物質(zhì)本身不發(fā)熒光；②熒光的產(chǎn)生與化合物結(jié)構(gòu)的關(guān)系不明確；③干擾因素多，光分解、氧淬滅、易污染。 

2. 主要應(yīng)用
（1）在生物領(lǐng)域的應(yīng)用

該領(lǐng)域主要用于臨床測(cè)定生物樣品中某些成分的含量，生物技術(shù)及免疫技術(shù)的分析等，如脫氧核糖和脫氧核糖核酸的含量測(cè)定、DNA、抗體、抗原等各方面的研究。在此領(lǐng)域中主要時(shí)利用各種熒光探針進(jìn)行分析檢測(cè)，主要分為生物納米熒光探針和生物非納米熒光探針。

其中納米技術(shù)的興起，打開(kāi)了熒光分析的又一個(gè)新的領(lǐng)域。由于納米材料具有很好的熒光性，寬激發(fā)，窄發(fā)射等優(yōu)良的光譜特點(diǎn)，使其成為熒光分析中的重要的研究對(duì)象，引起了研究者的興趣。

（2）在食品領(lǐng)域的應(yīng)用

該領(lǐng)域主要用于食品中礦物質(zhì)及金屬元素、氨基酸、維生素、菌類(lèi)污染、添加劑、防腐劑、食品包裝有害物質(zhì)、農(nóng)藥殘留等的分析檢測(cè)。特別是與HPLC、TLC、FIA等技術(shù)的結(jié)合可以更好的達(dá)到食品中各種物質(zhì)的檢測(cè)效果。

目前我國(guó)食品標(biāo)準(zhǔn)日趨化，對(duì)于食品分析的要求也越來(lái)越趨向于靈敏和微量化。熒光分析正可以滿(mǎn)足這方面的分析要求。

（3）在藥物分析中的應(yīng)用

藥物分析領(lǐng)域可以利用熒光分析進(jìn)行藥物的有效成分鑒定、藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究、臨床藥理藥效分析等。

藥物熒光分析可以分為三類(lèi)：直接熒光分析、間接熒光分析和納米熒光分析。
常規(guī)熒光分析法zui早被應(yīng)用于分析抗瘧疾藥物奎寧，隨著熒光分析法的發(fā)展，其應(yīng)用范圍日益擴(kuò)大，目前被廣泛用于抗菌素藥物、止痛藥、鎮(zhèn)靜劑、止血藥等的分析。

（4）在環(huán)境分析中的應(yīng)用

該領(lǐng)域主要利用熒光分析檢測(cè)環(huán)境中的物質(zhì)的含量，主要是對(duì)水體、礦石和土壤進(jìn)行檢測(cè)。隨著有機(jī)化工、石油化工、醫(yī)藥工業(yè)的發(fā)展, 以及農(nóng)藥( 殺蟲(chóng)劑、除草劑等) 的大量使用, 有機(jī)化合物對(duì)環(huán)境的危害和污染日益嚴(yán)重。

目前被列入有機(jī)污染物監(jiān)測(cè)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法中的熒光分析法有；冷原子熒光法對(duì)有機(jī)汞的測(cè)定；乙酰化濾紙層析熒光分光光度法對(duì)大氣飄塵和水體中苯并( a) 芘的測(cè)定；酚類(lèi) 、木質(zhì)磺酸酯、多環(huán)芳烴( 芘、螢、蒽) [ PASH]的熒光分析法測(cè)定等。

四、儀器發(fā)展方向

近年來(lái)，發(fā)展了各種新型熒光分析技術(shù)，如激光誘導(dǎo)熒光法、同步熒光法、導(dǎo)數(shù)熒光法、熒光探針?lè)ā⒐饣瘜W(xué)熒光法、時(shí)間分辨熒光法、三維熒光法、偏振熒光法、熒光免疫測(cè)定法、熒光成像技術(shù)、熒光光纖傳感器等。

這些技術(shù)的應(yīng)用加速了各種新型熒光分析儀器的研制，使熒光分析不斷朝著、痕量、微觀(guān)和自動(dòng)化方向發(fā)展。

隨著科技的發(fā)展，激光，微機(jī)，電子學(xué)等新技術(shù)的引進(jìn)，使熒光光譜儀在理論及實(shí)際應(yīng)用上都得到了快速的發(fā)展，主要發(fā)展方向如下：

（1）分辨率提高；
（2）掃描速度加快；
（3）多功能，可同機(jī)進(jìn)行熒光、磷光和化學(xué)發(fā)光測(cè)量；利用光纖傳感的平板掃描儀附件還可進(jìn)行薄層色譜分離斑點(diǎn)的掃描測(cè)定等；

（4）促使應(yīng)用技術(shù)的擴(kuò)展：
①時(shí)間分辨(相分辨)
②熒光偏振(熒光免疫)
③同步熒光
④三維熒光
⑤熒光光纖化學(xué)傳感器等分析新方法相繼出現(xiàn)，10-6S級(jí)熒光壽命的測(cè)定。

（5）緊湊型，便捷型。