4-甲基咪唑的液相色譜(HPLC)檢測方案

近日、據英國《每日郵報》報道，美國某公益組織檢測多個國家的可口可樂中4-甲基咪唑的含量，發現美國355毫升可口可樂中4-甲基咪唑含量為4微克，中國為56微克,英國為135微克，巴西則高達267微克。4-甲基咪唑源于生產飲料所用的焦糖色素中，焦糖色素與其他人工合成色素相比，具備價格價廉、安全無毒等優點，被越來越廣泛地應用于醬油、醋、可樂、冷飲等食品工業中。然而，因為焦糖色素在制造過程中往往要使用氨或銨鹽，這種物質和其它原輔料發生反應，生成附帶產物4-甲基咪唑。4-甲基咪唑為神經毒，能引起驚厥。長期食用會導致動物長腫瘤，有可能會對人體造成致癌風險。

針對“可樂致癌”事件，億鑫儀器參考大量的文獻方法，利用全新高性能的LC-10Tvp液相色譜儀，經實踐檢驗可提供焦糖色素中4-甲基咪唑的HPLC檢測方案，得出的結果準確可靠，檢出限好，僅供廣大用戶參考。

以下是液相色譜法對焦糖色素中的4-甲基咪唑的詳細檢測方法。

1、儀器與試劑

1．1儀器、設備

LC-10Tvp液相色譜儀

Vertex 色譜柱：150mm×4.6mm×5μm；

分析天平；

旋轉蒸發儀；

分液漏斗250ml；

振蕩器；

針頭過濾器；

微孔濾膜：0.45µm

1.2試劑

甲醇（色譜純）；

無水乙醇；

CHCl3；

CHCl3-無水乙醇萃取液（80: 20)：移取80 mL的
CHCl3及20 mL的無水乙醇混合均勻備用。

碳酸鈉。

碳酸鈉溶液（100 g/L )：準確吸取碳酸鈉100 g于1 000 mL容量瓶中，用水定容至刻度。

庚烷磺酸鈉

磷酸二氫鉀

磷酸

磷酸二氫鉀緩沖液（0.05mol/L）：稱取磷酸二氫鉀6.8g，庚烷磺酸鈉1g于1000ml容量瓶中，加水900ml，用稀磷酸調pH至3.5，用水定容至1000ml。

4-甲基咪唑標準品：純度>99 %o

4-甲基咪唑標準儲備溶液：準確稱取0. 1 000 g 4-甲基咪唑于100 mL的容量瓶中，用流動相溶解定容至刻度。4-甲基咪唑含量1. 0 mg/mL，作為貯備溶液。

2、試樣溶液的制備

準確稱取3g樣品（至0. 001 g)，加15mL水溶解，移入250 mL分液漏斗中，加100 g/L碳酸鈉溶液15 mL，加
CHCl3-無水乙醇萃取液60 mL，劇烈振搖5 min。靜置分層后，將有機相移入另一分液漏斗中，水相再按同樣方法萃取一次，合并有機相；用100 g/L碳酸鈉溶液洗滌提取液3次，每次30mL。然后將有機相通過無水硫酸鈉濾入旋轉蒸發瓶中，50℃濃縮至近干，取下，以水溶解殘渣并定容至10ml，經0.45µm微孔膜過濾后供HPLC分析。

3、色譜條件

色譜柱：C18, 4. 6 mmx250 mm，粒度5 µm

流動相：甲醇: 0. 05 mol/L磷酸二氫鉀緩沖液（(pH 3.5，含0. 1％庚烷磺酸鈉）=5: 95

波長：210nm

流速：1. 0 mL/min

4、樣品測定

標準曲線：將4-甲基咪唑標準溶液配置成一系列標準溶液，分別進標準系列溶液各10µL，進行HPLC分析，然后以峰面積為縱坐標，以4-甲基咪唑的含量為橫坐標，繪制標準曲線。

樣品測定：吸取10 µL試樣溶液進行HPLC分析，測定其峰面積，從標準曲線查得測定液中4-甲基咪唑的含量

5、4-甲基咪唑的標準色譜圖