內毒素

內毒素致病性

Pfeiffer于十九世紀首先提出“內毒素”一詞，研究表明，內毒素在機體內作用于單核巨噬細胞產生多種細胞因子（腫瘤壞死因子TNF，白細胞介素IL，干擾素Interferon，凝血素等）。當這些因子在機體內過量時，則可導致機體出現發熱、低血壓、休克、多器官功能衰竭甚至死亡。

因此，人和動物的注射藥物、生物制品和醫療器械的終端產品中的內毒素的檢測和去除顯得尤為重要。

內毒素結構

內毒素是革蘭氏陰性菌細胞壁的一部分，其主要成分為脂多糖（LPS），經細菌細胞裂解后釋放出來。LPS可以分為三個不同的結構域：特異性O鏈、核心寡聚糖和類脂A，如下圖所示：

內毒素特性

• 性質穩定：160℃的溫度下加熱2-4個小時，或用強堿、強酸或強氧化劑加熱煮沸30分鐘才能破壞它的生物活性。
• 經甲醛溶液處理后，可降低其毒性，但不能成為類毒素。

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  中國藥典（CP）規定，藥品、生物制品的細菌內毒素限值（L）一般按以下公式確定：

  L=K/M

   

  式中L為供試品的細菌內毒素限值，以EU/ml、EU/mg或EU/U（活性單位）表示；

  K為人每公斤體重每小時zui大可接受的內毒素劑量，以EU/(kg• h)表示，注射劑K=5 EU/(kg• h)，放射性藥品注射劑K=2.5 EU/(kg• h)，鞘內用注射劑K=0.2 EU/(kg• h)；

  M為人用每公斤體重每小時zui大劑量，以ml (kg• h)、mg(kg• h)或U/(kg• h)表示，人均體重按60 kg計算，人體表面積按1.62 m2計算，注射時間若不足1小時，按1小時計算。

  按人用劑量計算限值時，如遇特殊情況，可根據生產和臨床用藥實際情況做必要調整，但需說明理由。

   

  美國藥典（USP）規定，非經腸道藥品的內毒素限值，以劑量定義，等于：K/M。

  除了鞘內給藥以外的任何給藥途徑，K均為5 USP-EU/kg，鞘內給藥時，K為0.2 USP-EU/kg，對于非鞘內給藥放射性藥品，內毒素限值的計算為175/V，V為以ml為單位的zui大推薦劑量，對于鞘內給藥的放射性藥品，其內毒素限值為14/V，對于按以每平方體表面積計算的給藥劑量（通常是抗腫瘤藥品），計算公式為K/M，其中K=5 EU/kg，M為(zui大劑量/m2/小時×1.80m2)/70kg。

  檢測方法的建立：

  1968年，由Leivin和Bang發現并建立了利用鱟試劑檢測細菌內毒素的方法。他們發現，當遇到內毒素時，鱟的血液能夠凝結成塊。用鱟血液中的變形細胞提取物與待檢樣品混合，如果待檢樣品中含有內毒素，則會觀察到上述情況。鱟試驗法（LT）已經替代了熱原檢查家兔法檢驗藥品中的內毒素。

  目前FDA已經批準了以下LAL檢測法：凝膠法（ToxinSensorTM凝膠法內毒素檢測試劑盒）、濁度法和顯色法（ToxinSensorTM顯色法LAL內毒素檢測試劑盒）。

   

  LAL檢測方法原理圖

   

  

   

  半定量測定——凝膠法

  通過鱟試劑與內毒素產生凝集反應的原理來半定量內毒素的方法，是各國藥典細菌內毒素檢查的方法。

  定量測定——濁度法和顯色法

  濁度法（動態濁度法和終點濁度法）是通過鱟試劑與內毒素反應過程中的濁度變化來測定內毒素含量的方法。終點濁度法是基于細菌內毒素濃度和反應混合物的終點濁度( 吸收度或透光率) 之間的定量關系的一種檢測方法；動態濁度法（又稱動態比濁法）是檢測反應混合物的濁度上升某一預先設定的吸光度所需要的反應時間，或是檢測濁度增加速度的方法。

  顯色法（動態顯色法和終點顯色法）是將鱟試劑與內毒素反應，可使特定底物顯色，通過釋放出的呈色團的多少來測定內毒素含量，又稱為比色法。終點顯色法是依據反應混合物中內毒素濃度和其在孵育終止時釋放出的呈色團的量之間存在的量化關系來測定內毒素含量的方法。動態顯色法是檢測反應混合物的色度達到某一預先設定的吸光度所需要的反應時間, 或檢測色度增長速度的方法。

   

  內毒素檢測方法的選擇：

  凝膠法——僅需檢測樣品的內毒素*。此法操作比較簡單、經濟，不需要測定設備，可進行定性或半定量測定。

  顯色法（或濁度法）——定量測定樣品中內毒素含量。

• 日常檢測量不大時，可以選擇終點顯色法，用普通的分光光度計就可完成實驗。
• 檢測的樣品是生物制品、疫苗、血液制品等選用終點顯色法或動態顯色法。
• 檢測量比較大，檢測的樣品對鱟試劑的干擾不大，可選用動態濁度法鱟試劑。

• 注：動態濁度法與動態顯色法需要帶溫育系統的動態光度測定儀器及配套軟件。