在制藥行業中，通常使用分析儀器來評估某種產品是否符合要求的規范，以保證質量和安全性。在美國藥典中，通用章節<1058>USP介紹了分析儀器確認(AIQ)的準則，以確保所有儀器都能產生可靠且一致的數據。AIQ過程涉及在儀器使用壽命內相互關聯的活動，以確定其目的的適用性。這些活動可分為以下四類(見圖1):
設計確認包括儀器所需的功能和操作規范以及儀器預期用途的適用性。
安裝確認確保儀器和軟件按照設計和規定進行安裝和配置。所有活動均有文件記錄。
操作確認用于確認儀器是否按預期運行。還測試了包括安全數據存儲、備份和歸檔在內的軟件功能。所有活動均有文件記錄。
性能確認控制儀器在現實世界使用條件下按規定執行。
在本文中，對珀金埃爾默Lambda 365+紫外/可見分光光度計進行了操作確認。
圖1.分析儀器確認過程
1 操作確認
紫外/可見分光光度計是一種用途廣泛的儀器，在制藥領域有著廣泛的應用。當在規定的環境中操作時，紫外/可見分光光度計(如應用的任何其他儀器)需要經過確認性驗證，并保證分析結果可靠且一致，從而滿足質量要求。在國際藥典的特定章節中列出了相關指南，包括《美國藥典》(USP<857>)和《歐洲藥典》(EP 2.2.25)，其中詳細說明了驗證紫外/可見分光光度計性能的程序。雖然2019年對EP 2.2.25進行了修訂，但USP<857>的最新版本是2022年12月發布的。
在這些指南中，要求對紫外/可見分光光度計的性能進行驗證，以確認以下參數符合規定要求:
強烈建議使用國家和國際監管機構或認證機構認可的認證參考物質(CRM)進行測試，而不是使用更容易出錯的自制標準品。
在本文中，根據USP<857>和EP 2.2.5在LAMBDA 365+紫外/可見分光光度計上進行測試(LAMBDA 365+Touch也可以獲得類似結果)。作為通用操作確認(UOQ)方案的一部分，使用珀金埃爾默One Source服務提供的安全加密報告系統顯示每次測試的結果。UOQ方案還包括日本藥典合規性，因為LAMBDA 365+也可以完全符合日本藥典標準。該報告涵蓋符合ASTM-E-291和FDA MAN-0000482的通過/不通過結果和內置計算，使用數字證書技術防止復制和篡改，同時符合21CFR第11部分標準。
2 波長控制
LAMBDA 365+紫外/可見光分光光度計是一種基于單色器的分光光度計，通過電機驅動移動反光鏡和光柵來實現波長的選擇。這種選擇的準確度至關重要，并且當測量表現出窄吸收峰的樣品時變得更加重要。可以使用以下一個或多個標準品來控制波長光譜的紫外和可見光區的波長準確度:
在本文中，使用高氯酸溶液中的氧化鈰、高氯酸溶液中的氧化鈥和釹鐠玻璃濾光片來覆蓋紫外和可見光區。對于每個標準品，收集六個吸收光譜來評估觀察到的峰的準確度。使用UV WinLab軟件中直接創建的簡單處理方程提取峰值波長。在圖3、圖4和圖5中，報告了為每個CRM收集的六個吸收光譜中的一個。圖6的報告中報告了不同峰值獲得的波長，以及從六個光譜中獲得的平均值與認證波長值之差(“Diff mean與Cert”)，以評估準確度。根據要求，在USP<857>(報告左側部分)的情況下，測量精確度也被指定為標準偏差(“SD”)及其四舍五入值。所有結果均大大優于兩部藥典設定的限值，測試證實了Lambda 365+紫外/可見分光光度計的波長準確度。
表1.用于波長控制的儀器參數--氧化鈰溶液、氧化鈥溶液、釹鐠玻璃
圖3.用于波長準確度控制的高氯酸中氧化鈰的吸收光譜(為本標準品收集的六個光譜之一)
圖4.用于波長準確度控制的高氯酸中4%氧化鈥溶液的吸收光譜(為本標準品收集的六個光譜之一)
圖5.用于波長準確度控制的釹鐠玻璃的吸收光譜(為本標準品收集的六個光譜之一)用于波長控制的吸收峰位于681.02nm和875.74nm處
圖6.使用氧化鈰溶液、氧化鈥溶液和釹鐠玻璃控制紫外線、可見光和擴展可見光區(左側為USP<857>，右側為EP 2.2.25)波長的結果（點擊查看大圖）
3吸光度控制
紫外-可見分光光度計光度響應的評估是確保讀數準確無誤的基礎。當按照朗伯-比爾定律進行定量分析以確定分析物濃度時，這變得更加重要。吸光度控制程序要求測量標準物質在特定波長下的吸收值，以覆蓋預期的應用光譜范圍，以及至少兩個吸光度水平范圍。將獲得的值與所用CRM的報告值進行比較，并檢查準確度和精確度是否低于規定限值(見圖7)。
可使用的標準品如下:
在本文中，使用重鉻酸鉀(60mg/L和160mg/L)和三個中性密度玻璃濾光片。對于每個波長，收集六個重復樣品，并計算相應的平均值和標準偏差，如圖7和圖8所示。所有測試均順利通過，認證吸收率和實測吸收率之間的差異甚至比藥典標準要求的限值高出一個數量級。
表2.用于控制吸光度的儀器參數--重鉻酸鉀溶液
圖7.吸光度控制值--重鉻酸鉀溶液（點擊查看大圖）
圖8.吸光度控制值--中性密度玻璃濾光片（點擊查看大圖）
4 吸光度線性
吸光度線性測試是吸光度控制的擴展，其中在預期光譜范圍內測試光度響應的線性。推薦用于控制吸光度的CRM和相同的儀器設置參數(見表3)也可用于控制紫外線和可見光區的吸光度線性。可接受標準規定，判定系數(R2)必須大于0.999。將吸光度測試控制過程中獲得的吸光度值與認證的吸光度值進行繪圖，以計算R2，R2為1.000，證實吸光度線性(見圖9)。最新版本的USP<857>不再需要此測試。
表3.用于控制吸光度的儀器參數--中性密度玻璃濾光片
圖9.吸光度線性測試的結果吸光度值是從吸光度控制測試中獲得的（點擊查看大圖）
5 雜散光限值
雜散光是指到達探測器的所有不需要的輻射，即使這種輻射不是根據所選波長的帶寬選擇的。雜散光主要是由色散元件中的缺陷引起的，例如單色器的光柵組件、衍射效應或損壞/磨損的組件。這導致了與朗伯-比爾定律的負偏差，并設置了儀器可能的最大吸光度值的上限。雜散光對于高濃度樣品來說更為重要，因為雜散光成分可能代表到達探測器的輻射的最大部分。截止濾光液用于確定雜散光限值。這些溶液吸收低于特定波長的光，同時透射更高波長的光。可以通過測量低于這種截止波長的吸光度來獲得雜散光，其中任何透射的光都是由雜散光提供的。推薦的CRM截止濾光液如下:
在本文中，使用了上述所有CRM標準品。根據USP<857>，有兩種程序可用于控制雜散光。程序A要求使用5 mm比色皿收集截止標準溶液的吸光度，并從使用10 mm比色皿中的相同截止標準溶液獲得的吸光度中減去所得值。程序B要求測量裝滿截止濾光液的10mm比色皿相對于裝滿適當參比溶液的10mm比色皿的吸光度。在本研究中，遵循了與EP.2.2.25中所述相同的程序B(儀器參數見表4)。為所有CRM收集的所得吸光度值高于可接受限值(吸光度值等于10表示儀器飽和)，確認儀器通過雜散光控制極限(見圖10)。
表4.用于雜散光限值的儀器參數
圖10.雜散光限值測試結果吸光度值等于10表明儀器已飽和（點擊查看大圖）
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6 光譜分辨率
分光光度計的光譜分辨率是指其將兩個相鄰峰分解為單獨峰的能力。分辨率與分光光度計的狹縫和用于收集光譜的數據點間隔有關。SBW(光譜帶寬)定義為在來自單色器的光帶最大強度的一半處測量的寬度，其與儀器的物理狹縫有關。通過在分光光度計中設置較低的狹縫值來選擇較低的SBW將保證分辨率更佳，盡管這可能會導致噪聲更大(穿過樣品的光會更少)。通常，建議將狹縫設置在分析物吸收帶FWHM(半峰全寬)的1/8左右。用于確定分光光度計光譜分辨率的CRM標準品如下:
通過測量在269 nm處收集到的最大吸收值和在266 nm處收集到的最小吸收值之比來確定光譜分辨率(已烷中甲苯的吸收光譜見圖11)。用于光譜分辨率測試的儀器設置參數如表5所示。266 nm和269 nm處的吸收值是使用處理方程獲得的，該處理方程從光譜中提取吸收值，然后減去在300 nm處獲得的基線。可以很容易地直接在UV WinLab軟件中創建處理方程。發現該比率等于2，并且由于驗收限值為A269/A266>1.3，測試順利通過(見圖12)。
表5.光譜分辨率測試的儀器參數
圖11.已烷 (0.020% v/v)溶液中甲苯的吸收光譜(用于光譜分辨率測試)（點擊查看大圖）
圖12. 光譜分辨率測試的結果（點擊查看大圖）
結論
珀金埃爾默LAMBDA 365+紫外/可見分光光度計不僅符合，而且超過了全球藥典標準USP<857>和EP 2.2.25(該儀器也符合日本藥典標準)指南規定的要求。所有對照測試均順利通過，證實Lambda 365+將提供可靠的結果并確保高質量的數據。使用超安全報告顯示每次測試的結果，該報告是珀金埃爾默One Source服務執行的UOQ(通用操作確認)的一部分。
本文件使用數字證書技術提供安全的加密報告，以防止修改、刪除或復制，從而符合21 CFR第11部分標準。控制LAMBDA 365+紫外/可見分光光度計的UV WinLab增強安全(ES)軟件也完全符合21 CFR第11部分的規定，為制藥行業的實驗室提供了信任其結果和依賴其數據完整性的最佳解決方案。
參考文獻
1.ASTM-E-29:“Standard Practice for Using Significant Digits in Test Data to Determine Conformance with Specifications”.
2.FDA MAN-000048:“ORA Lab Manual Vol. lll Section 4-Basic Statistics and Data Presentation”.
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