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賽默飛 TRIzol 試劑是一種即用型試劑，該和 Guanidine isothiocyanate 的單相溶液設計用于在1小時內從人類、動物、植物、酵母或細菌來源的細胞和組織樣本中提取高質量的總RNA（以及DNA和蛋白質），TRIzol試劑在樣本勻漿化時，可以破壞細胞，溶解細胞組分，同時高效的抑制RNA酶的活性，從而維持RNA的完整性。

TRIzol™ 試劑的主要特點包括：

? 可從同一樣品中分離 RNA、DNA 和蛋白
? 擁有的裂解能力，甚至可處理困難的樣品類型（CN）₂
? 針對組織、細胞、血清、病毒和細菌進行優(yōu)化的配方和方案

從多種樣品體積和來源中可靠純化 RNA
TRIzol™ 試劑可很好地處理少量組織 (50–100 mg) 和細胞 (5 × 10⁶) 以及大量組織 (≥1 g) 和細胞 (>10⁷)，且包含用于從人、動物、植物或細菌來源的樣品中進行純化的方案。TRIzol™ 試劑通過在樣品均質化期間高效抑制 RNase 活性維持 RNA 的完整性，同時破壞細胞并溶解細胞組分。TRIzol™ 試劑方法的簡單性使其可同時處理大量樣品。可在不到 1 小時的時間內完成整個程序。通過 TRIzol™ 試劑分離的總 RNA 不含蛋白和 DNA 污染。

其配方可分離多種分子靶標
TRIzol™ 試劑可使您連續(xù)沉淀單份樣品中的 RNA、DNA 和蛋白。使用 TRIzol™ 試劑均質化樣品后，加入氯仿，使勻漿分離成透明的上層水層（含 RNA）、中間相和紅色下層有機層（含 DNA 和蛋白）。使用異丙醇從水層中沉淀出 RNA。使用乙醇從中間相/有機層中沉淀出 DNA。通過異丙醇沉淀從-乙醇上清液中沉淀出蛋白。將沉淀出的 RNA、DNA 或蛋白洗滌以去除雜質，然后重懸以用于下游應用。

TRIzol 使用必學小妙招

準備階段：

1. 確保實驗環(huán)境無核酸酶污染，可以使用 RNaseZap™ RNase 去污溶液（貨號 AM9780）去除實驗臺表面和非一次性物品。

2. 實驗過程中，請使用一次性手套和不含核酸酶的一次性槍頭和離心管，防止引入核酸酶污染。

3. 準備好相應的實驗材料：

a. 提取 RNA：異丙醇，乙醇（75%），0.5% SDS 溶液。

b. 提取 DNA：乙醇（99%），乙醇（75%），0.1 M檸檬酸鈉溶于 10% 乙醇，8 mM NaOH，HEPES。

c. 提取蛋白質：異丙醇，乙醇（99%），含 0.3 M 鹽酸胍的 95% 乙醇，1% SDS 溶液。

tips

實驗環(huán)境和實驗用品的核酸酶污染是導致 RNA 實驗失敗的重要因素，做好核酸酶清除工作，使用無核酸酶的實驗用品，可以讓我們實驗事半功倍哦！

實驗步驟：

裂解樣本

1. 根據不同樣本材料在 TRIzol 試劑中裂解并勻漿化樣本。

a. 組織：每 50～100 mg 組織加入 1 mL TRIzol 試劑，用勻漿儀對樣本進行勻漿化。

b. 單層培養(yǎng)細胞：移除培養(yǎng)基，每 1×10⁵～10⁷個細胞加入 0.3～0.4 mL TRIzol 試劑，反復吹打勻漿化樣本。

c. 細胞懸液：離心后棄除上清液，收集細胞，每 0.25 mL 樣本加 0.75 mL 的 TRIzol 試劑，反復吹打以勻漿化。

tips

1）在 TRIzol 試劑中可以防止 RNA 降解，故加入 TRIzol 試劑前，不要洗滌細胞。

2）樣本體積不應超過用于裂解的 TRIzol 試劑體積的 10%。

2. 孵育 5 分鐘，隨后每 1 mL TRIzol 試劑添加 0.2 mL 氯仿，蓋緊蓋子，劇烈混勻。孵育 2~3 分鐘。4℃ 下 12,000×g 離心 15 分鐘。

3. 此時混合物分離成為三層，如下圖，我們需要將對應提取部分吸出進行后續(xù)操作。

tips

Invitrogen™ Phasemaker 分層管（貨號：A33248，A33249）可在 TRIzol 混合物樣品的水相和有機相間形成一層牢固可靠的膠封，使科研人員能夠輕松移取 RNA 相。

RNA 提取

1. RNA 沉淀：取盡上層水相，每 1 mL TRIzol 試劑加 0.5 mL 異丙醇。4℃ 孵育10分鐘。4℃ 下 12,000×g 離心 10 分鐘。此時底部的白色膠狀沉淀即為總 RNA 沉淀。棄上清液。

2. RNA 洗滌：每 1 mL 用于裂解的 TRIzol 試劑，用 1 mL 75% 乙醇重懸沉淀。瞬時漩渦震蕩，在 4℃ 下 7,500×g 離心 5 分鐘。棄上清，RNA 沉淀在空氣中干燥 5～10 分鐘。

3. RNA 溶解：用 20～50 μL 不含 RNase 的水，0.1 mM EDTA 或 0.5% SDS 溶液，反復吹打重懸沉淀。在 55～60℃ 孵育 10～15 分鐘，然后繼續(xù)下游實驗或者 -70℃ 長期保存。

tips

1）如果起始樣本很小（< 10⁶ 個細胞或 < 10 mg 組織），請將 5～10 μg 不含 RNase 的糖原作為載體加入到水相中，這樣有助于促進 RNA 沉淀。

2）如果 RNA 會在隨后的酶促反應中使用，則切勿將 RNA 溶解在 0.5% SDS 溶液中。

DNA 提取

1. DNA 沉淀：棄除上層水相，剩余相中每 1 mL 用于裂解的 TRIzol 試劑添加 0.3 mL 99% 乙醇，蓋緊管蓋，反復顛倒混勻。孵育 2～3 分鐘。4℃ 下 2,000×g 離心 5 分鐘，沉淀 DNA，移除溶有蛋白質的上清液。

2. DNA 洗滌：每 1 mL 用于裂解的 TRIzol 試劑加 1 mL 含 10% 乙醇的 0.1 M 檸檬酸鈉（pH 8.5）重懸沉淀。孵育 30 分鐘，偶爾輕輕顛倒混合。4℃ 下 2,000×g 離心 5 分鐘，棄上清液。重復洗滌步驟一次。對于 DNA 含量較大的樣本（＞ 200 μg）可以重復洗滌步驟兩次。每 1 mL 用于裂解的TRIzol試劑加入 1.5～2 mL 75% 乙醇重懸沉淀，孵育 10～20 分鐘，偶爾輕輕顛倒混合。4℃ 下 2,000×g 離心 5 分鐘，棄上清液，沉淀風干 5～10 分鐘。

3. DNA 溶解：用 0.3～0.6 mL 的 8 mM NaOH 上下吹打重懸沉淀，4℃ 下 12,000×g 離心 10 分鐘，轉移上清至新管子中。加 HEPES 調整 PH 用于下游應用或用 HEPES 和 1 mM EDTA 調節(jié) PH 至 7～8 長期存儲于 -20℃。

tips

干燥 DNA 的時候，不要用真空離心干燥，會影響 DNA 質量以及后續(xù) DNA 溶解。

蛋白質提取

1. 蛋白質沉淀：棄除上層水相，剩余相中每 1 mL  用于裂解的 TRIzol 試劑添加 0.3 mL 99% 乙醇，蓋緊管蓋，反復顛倒混勻。孵育 2～3 分鐘。4℃ 下 2,000×g 離心 5 分鐘，沉淀 DNA。上清轉移至新管中，每 1 mL 用于裂解的 TRIzol 試劑加 1.5 mL 異丙醇，孵育 10 分鐘。在 4℃ 下 12,000×g 離心 10 分鐘，棄上清液，留蛋白質沉淀。

2. 蛋白質洗滌：每 1 mL 用于裂解的 TRIzol 試劑需要加 2 mL 的含 0.3 M 鹽酸胍的 95% 乙醇至沉淀中，孵育 20 分鐘。在 4℃ 下 7,500×g 離心 5 分鐘。棄上清液，沉淀在干燥空氣中靜置 5～10 分鐘。

3. 蛋白質溶解：加入 200 μL 1% SDS 溶液，反復吹打重懸。4℃ 下 10,000×g 離心 10 分鐘，將上清轉移到新管中。檢測蛋白質濃度并用于下游應用或者長期存儲與 -20℃ 中。

tips 

蛋白質溶解步驟中的重懸，在 50℃ 水浴或者金屬浴中孵育，有助于沉淀重懸充分。