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賽默飛推出Q Orbitrap旗艦機(jī)Orbitrap Exploris™ 480已經(jīng)有一段時(shí)間了，集結(jié)了LFQ, TMT10plex, TMT11plex, TMT16plex及TurboTMT, vDIA, HR-DIA, BoxCarDDA, BoxCarDIA, PRM及SureQuant等一系列定量功能，相信大家對(duì)其整體的定量性能充滿好奇。

本期我們將要帶大家走入Exploris 480的定量之路。

 

1.Orbitrap Exploris™ 480質(zhì)譜儀——精zhun的非標(biāo)記定量

FAIMS Pro可以通過(guò)多肽帶電性質(zhì)的不同分離肽段，從而作為一種在線的氣態(tài)樣品分級(jí)手段來(lái)提高復(fù)雜樣品的定性和定量效率。Exploris 480搭載FAIMS Pro，數(shù)據(jù)分析采用Proteome Discoverer2.4，將FDR設(shè)置為1%，60min和120min可分別從1ug Hela全細(xì)胞酶解產(chǎn)物中鑒定近6300個(gè)和7300個(gè)蛋白（圖1）。

 

圖1. Orbitrap Exploris™ 480 搭載FAIMS Pro的鑒定結(jié)果

 

用全細(xì)胞酶解產(chǎn)物評(píng)估非標(biāo)記定量的重現(xiàn)性亦得到很好的結(jié)果，三次重復(fù)的重現(xiàn)性高達(dá)97%，蛋白定量CV值低至5%（圖2）。

圖2. Orbitrap Exploris™ 480非標(biāo)記定量的重現(xiàn)性評(píng)估

 

2.FAIMS Pro 接口——TurboTMT助力多重蛋白質(zhì)組學(xué)研究

10標(biāo)以及11標(biāo)的TMT定量憑借其“高產(chǎn)"的優(yōu)勢(shì)，一直備受歡迎。對(duì)于高于10標(biāo)的TMT定量而言，相鄰報(bào)告離子基團(tuán)僅存在6mDa的質(zhì)量差異，至少需要采用35,000的分辨率進(jìn)行準(zhǔn)確分辨，只能在Orbitrap平臺(tái)上實(shí)現(xiàn)；另外，共流出肽段的干擾也會(huì)影響TMT-MS²定量準(zhǔn)確性。因此，10標(biāo)以及11標(biāo)的TMT定量也一直受到掃描速度和共流出肽段干擾兩個(gè)問(wèn)題的困擾。針對(duì)這兩個(gè)問(wèn)題，Exploris 480上給出了完整的解決方案（圖3）。

圖3. Orbitrap Exploris™ 480的TMT定量的性能評(píng)估

 

Exploris 480的TurboTMT采用ΦSDM譜圖后處理算法，當(dāng)使用15,000分辨率采集數(shù)據(jù)時(shí)，報(bào)告離子處的分辨率達(dá)到了50,000，從而在保證區(qū)分質(zhì)量虧損級(jí)差異的報(bào)告離子前提下提升掃描速度；Exploris 480搭載FAIMS Pro，基于價(jià)態(tài)在線分級(jí)可以緩解共流出肽段干擾的問(wèn)題，從而提高定量準(zhǔn)確度。TMT11標(biāo)酵母標(biāo)準(zhǔn)品的結(jié)果也證明，Exploris 480結(jié)合Turbo-TMT和FAIMS Pro可顯著提升了樣品的定量深度和準(zhǔn)確性（圖4）。

圖4. Turbo-TMT和FAIMS Pro顯著提升定量深度和準(zhǔn)確性

 

3.DIA分析方案

隨著蛋白質(zhì)組學(xué)的進(jìn)一步發(fā)展，尤其對(duì)于精zhun醫(yī)學(xué)、臨床大隊(duì)列轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)等研究，DIA分析策略也備受青睞。結(jié)合Orbitrap超高分辨質(zhì)譜在蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)優(yōu)勢(shì)，賽默飛在2018年ASMS上提出了基于微流液相和Orbitrap超高分辨質(zhì)譜的數(shù)據(jù)非依賴采集工作流(HRMS1-DIA)，采用超高分辨一級(jí)掃描定量策略(R>120,000)。

 

我們使用已知組成的人、酵母、大腸桿菌混合樣品，在11個(gè)實(shí)驗(yàn)室對(duì)HRMS1-DIA工作流進(jìn)行定量準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性的長(zhǎng)期多中心驗(yàn)證（圖5）。各實(shí)驗(yàn)室平均可以鑒定到超過(guò)8000個(gè)蛋白，定量超過(guò)6000個(gè)蛋白，且定量準(zhǔn)確度高于0.9。

圖5. HRMS1-DIA的長(zhǎng)期多中心驗(yàn)證。

A. 蛋白鑒定和定量數(shù)量;

B. 實(shí)驗(yàn)室間的蛋白定量散點(diǎn)圖;

C.日間鑒定及定量蛋白的重現(xiàn)性

4.BoxCar分析流程

2018年Matthias實(shí)驗(yàn)室在Nature Methods上發(fā)表了全新的BoxCar采集方式，一級(jí)全掃采用分段累積合并掃描的方式，降低高豐度肽段對(duì)低豐度肽段的信號(hào)壓制，提升一級(jí)掃描的動(dòng)態(tài)范圍，從而增加血漿等動(dòng)態(tài)范圍大的樣本解析深度（圖6）。

圖6. BoxCar工作流程示意圖

 

 

Exploris 480為客戶提供更為便捷的BoxCar DDA 和BoxCar DIA 定量新方案（圖7），極大的豐富了現(xiàn)有的定量流程。

圖7. Orbitrap Exploris™ 480質(zhì)譜的BoxCar操作界面

 

 

5.靶向定量的新思路b

就如眾多研究對(duì)高通量信息挖掘的需求一樣，差異蛋白的高可信量化也至關(guān)重要。傳統(tǒng)檢測(cè)方法多基于免疫反應(yīng)，常常會(huì)受到抗體的可獲得性、特異性和穩(wěn)定性的困擾。平行反應(yīng)監(jiān)測(cè)（Parallel Reaction Monitoring,PRM）是Orbitrap超高分辨系列儀器上的靶向定量方法，采用高分辨掃描，可有效排除復(fù)雜基質(zhì)干擾。相比于傳統(tǒng)的SRM和MRM，PRM采用高分辨二級(jí)全掃，無(wú)需優(yōu)化碰撞能量，無(wú)需子離子，方法開發(fā)更加簡(jiǎn)單，是目前已被廣泛運(yùn)用的金標(biāo)驗(yàn)證方法。

 

與此同時(shí)，經(jīng)常也會(huì)被問(wèn)到的一個(gè)問(wèn)題：一針采集中PRM能監(jiān)測(cè)多少條肽段？基于2015年Gallien等人在MCP上發(fā)表的IS-PRM思路，Exploris 480上提供了更強(qiáng)健、更便捷的SureQuant定量新方法(圖8)。

 

圖8. SureQuant定量新方法

 

SureQuant IS 靶標(biāo)分析250ng含有50fmol 內(nèi)標(biāo)的細(xì)胞酶解物，如圖9所示，相比于PRM20%的生產(chǎn)力，SureQuant方法將生產(chǎn)力提高至80%；此外，SureQuant不依賴于預(yù)設(shè)保留時(shí)間，能夠?qū)崿F(xiàn)可靠穩(wěn)定的靶標(biāo)定量。

 

圖9. SureQuant改善生產(chǎn)力(圖9a)和保留時(shí)間漂移(圖9b)的限制

 

 

我們以AKT/mTOR通路分析作為一個(gè)例子，基于Capillary流速LC-MS平臺(tái)，以Hela全蛋白酶解產(chǎn)物為樣品，對(duì)AKT/mTOR通路中的12個(gè)蛋白/30條肽段進(jìn)行PRM和SureQuant靶向定量分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，SureQuant的肽段檢出效率明顯高于PRM（圖10）。

 

圖10. SureQuant靶向監(jiān)測(cè)酶解產(chǎn)物中AKT/mTOR 通路的內(nèi)源肽段

 

定量蛋白質(zhì)組學(xué)完整解決方案

Orbitrap Exploris^™ 480質(zhì)譜儀作為全新一代Q Orbitrap系列旗艦機(jī)，具備ji佳的性能和重現(xiàn)性。擁有LFQ，TMT及TurboTMT，DIA、HR-DIA、BoxCar、PRM及SureQuant等多樣化的定量解決方案，在同一臺(tái)儀器上完成從大規(guī)模發(fā)現(xiàn)到靶向驗(yàn)證所有工作，是蛋白質(zhì)組學(xué)、精zhun醫(yī)學(xué)、生物制藥等研究的。

 

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