上一期中我們介紹了Orbitrap Eclipse™三合一質(zhì)譜儀極其出色的硬件性能，以及在蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域的非凡表現(xiàn)。本期帶大家領(lǐng)略其如何將生物制品質(zhì)譜表征工作變得更簡單、看到生物制品最真實(shí)的原貌！

當(dāng)前常規(guī)生物制品質(zhì)譜表征主要包含完整分子量的測定、肽圖解析、糖型鑒定等，通常利用不同的樣品前處理獲得復(fù)雜生物制品的完整分子量、氨基酸序列結(jié)果，然而在一定程度上卻失去了樣品的完整信息，引入其他副反應(yīng)。大家知曉可以用Top-Down、Middle-Down的分析流程解決這一問題，但由于質(zhì)譜儀性能的局限，未得到廣泛的應(yīng)用。

賽默飛作為科研領(lǐng)域的先者，致力于解決分析難題，型Orbitrap Eclipse™將“簡單又復(fù)雜"的生物制品質(zhì)譜表征帶入了“Top/Middle-Down時(shí)代"。

 

 

1復(fù)雜生物制品的完整分子量測定——糖基化位點(diǎn)較多的融合蛋白類

得益于PTCR（質(zhì)子轉(zhuǎn)移電荷減少）技術(shù)、深度真空技術(shù)（氣壓可調(diào)0.5-20mTorr）。

單克隆抗體及ADC類蛋白樣品異質(zhì)性相對(duì)較低，在傳統(tǒng)的LC-MS/MS（變性反相色譜或非變性分子排組色譜條件）中能夠獲得高信噪比、高質(zhì)量精度的各成分及其含量分布。而含N-糖或O-糖位點(diǎn)較多的融合蛋白類，如細(xì)胞因子融合蛋白，異質(zhì)性非常高，即使在非變性去唾液酸條件下仍舊無法有效區(qū)分每一成分（圖1A），通常的解決方式是使用各種糖苷酶去除不同種類糖型，降低譜圖復(fù)雜性，然而卻失去了樣品的完整水平糖型信息。

圖1. 細(xì)胞因子融合蛋白分子量測定; 1A. 去唾液酸后在native條件質(zhì)譜圖 1B.經(jīng)過PTCR反應(yīng)后質(zhì)譜圖 1C.經(jīng)BioPharma軟件去卷積后的各成分質(zhì)量(Data Courtesy: Wendy Sandoval, Genentech)

Orbitrap Eclipse™ 針對(duì)不同的樣品分析可調(diào)節(jié)IRM中氣壓，提高信號(hào)響應(yīng)，以及PTCR強(qiáng)力的加持技術(shù)則可簡單快速的解決此類困擾已久的難題，如圖1所示，在圖1A中選擇帶多質(zhì)子且信號(hào)強(qiáng)度較高的m/z5677-5757范圍，經(jīng)PTCR反應(yīng)后降低質(zhì)子數(shù)，從而降低各電荷態(tài)間的重疊度（圖1B），此時(shí)可清晰的分辨每一成分，BioPharma Finder軟件去卷積后獲得該融合蛋白主要成分的分子量（圖1C），為復(fù)雜生物制品的表征提供完整信息。

2非變性蛋白Top-Down分析

得益于ETD、EThcD、UVPD、HCD、深度真空技術(shù)、HMR?、PTCR技術(shù)

（型Orbitrap Eclipse™三合一質(zhì)譜儀集各種利器于一身）

對(duì)于做蛋白藥物質(zhì)譜表征分析的人來說，理想的狀態(tài)是使用快速簡單甚至無需樣品前處理，直接進(jìn)入LC-MS/MS或MS only對(duì)蛋白藥物進(jìn)行表征，高效且降低樣品前處理引入的干擾，同時(shí)可直接對(duì)電荷變異體成分進(jìn)行快速的確證。而現(xiàn)實(shí)是由于抗體分子大，碎片離子少且復(fù)雜導(dǎo)致在完整蛋白水平獲得較低的序列覆蓋度，實(shí)用價(jià)值低。Orbitrap Eclipse™將非變性完整蛋白Top-Down分析推向嶄新的高度。

以Herceptin®抗體為例，溶液置換成50mM乙酸銨（Herceptin®濃度為2ug/uL），不經(jīng)LC通過注射泵直接進(jìn)入MS中，獲得高信噪比高質(zhì)量精度的一級(jí)譜圖（圖2），隔離豐度的母離子（+27價(jià)）分別進(jìn)行HCD、ETD、EThcD及UVPD的碎裂，且使用Orbitrap 240,000分辨率進(jìn)行高準(zhǔn)確度二級(jí)碎片離子掃描，由于Orbitrap Eclipse™具有HMR?選項(xiàng)，可在二級(jí)譜圖中看到m/z達(dá)8000的豐富碎片離子。

圖2.非變性Herceptin®高質(zhì)量精度的一級(jí)質(zhì)譜圖，不同碎裂模式下的二級(jí)質(zhì)譜圖

 

圖3. 經(jīng)BioPharma Finder解析后輕重鏈氨基酸序列覆蓋度

經(jīng)BioPharma Finder解析后，輕鏈氨基酸序列覆蓋度為57%，重鏈氨基酸序列覆蓋度為36%（圖3），碎片離子質(zhì)量偏差在3ppm以內(nèi)，Orbitrap Eclipse™在非變性條件下Top-Down結(jié)果刷新了以往的記錄?1?。

 

值得注意的是，PTCR技術(shù)不僅在復(fù)雜生物制品分子量測定中大顯身手，而且能夠顯著降低ETD MS2譜圖的復(fù)雜度（圖4），大大提高質(zhì)量碎片離子的解析度（圖5），從而提升Middle-Down氨基酸序列的覆蓋度（圖6）。

圖4.NIST mAb Fd亞基經(jīng)ETD碎裂以及PTCR反應(yīng)后的二級(jí)碎片離子質(zhì)譜圖

 

圖5.ETD only與ETD with PTCR二級(jí)/三級(jí)碎片離子鑒定分布圖

 

圖6.NIST標(biāo)準(zhǔn)抗體Middle-Down氨基酸序列覆蓋度

3基于以上的優(yōu)勢性能，可進(jìn)一步擴(kuò)展其應(yīng)用領(lǐng)域

如電荷變異體的快速鑒定；利用MHC(Major Histocompatibility Complex)-peptide復(fù)合物篩選高免疫原性疫苗時(shí)，采用Orbitrap Eclipse™測定復(fù)合物的完整分子量和Top-Down，來評(píng)估多肽的交換（圖7）；此外多種碎裂方式與超高分辨率Orbitrap的組合能夠更加準(zhǔn)確的對(duì)未知蛋白進(jìn)行從頭測序（De-novo sequencing）。

圖7.Orbitrap Eclipse™評(píng)估MHC與多肽的交換，助力高免疫原性疫苗的篩選（Data Courtesy :Genentech）

 

結(jié)語：目前Orbitrap Eclipse™是功能齊全的高分辨質(zhì)譜儀之一，旨在解決蛋白質(zhì)分析中挑戰(zhàn)的問題，持此利器定能推動(dòng)生物學(xué)研究的進(jìn)一步發(fā)展。

至此，ASMS新品連載正式完結(jié)啦！快和賽默飛一起回顧下賽默飛2019新品質(zhì)譜的精彩瞬間~

賽默飛于ASMS 2019上發(fā)布的兩款新品質(zhì)譜再次刷新了Orbitrap的記錄——

全新一代Q Orbitrap旗艦機(jī) Orbitrap Exploris™480 質(zhì)譜儀，體積小巧但性能，穩(wěn)定耐久。天才不“繁"，勢必將蛋白質(zhì)組學(xué)，尤其是臨床蛋白質(zhì)組學(xué)研究推向新的高度。

堪稱創(chuàng)新之作的型Orbitrap Eclipse™三合一質(zhì)譜儀，集各種高能軟硬件技術(shù)于一身，性能比尖，輕松應(yīng)對(duì)蛋白質(zhì)組學(xué)，生物制藥與蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)分析研究中的各項(xiàng)挑戰(zhàn)。

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