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   人們采取無菌操作的方法，把某種食用菌從混雜的微生物中，單獨地分離開來，這個過程叫做菌種分離。從分離過程中得到的菌絲體純化后，就是純菌種。在實驗室條件下，以人工使純菌種大量生長和繁殖的方法，叫做培養。下面由小編帶大家了解一下，如何培養菌種。

   1.1材料

1.1.1 菌種 枯草芽孢桿菌。

1.1.2 培養基 （1）LB培養基：蛋白胨10g，酵母膏5g，NaCl10g，蒸餾水1000ml，pH為7，（可溶性淀粉20g）瓊脂20g。

（2）篩選用培養基：含有2%可溶性淀粉的LB培養基。 

（3）種子培養基：豆餅粉4%，玉米粉3%，Na2HPO40.8%，(NH4)2SO40.4%，NH4Cl0.15%，H2O。

（4）發酵培養基：豆餅粉5.6%，玉米粉7.2%，Na2HPO40.8%，(NH4)2SO40.4%， NH4Cl0.13%，CaCl20.13%，α—淀粉酶50g。

   【2】 1.1.3 主要試劑

蔗糖、葡萄糖、淀粉、玉米淀粉、麥芽糖、酵母浸出物、胰蛋白胨、(Beef Extract）、尿素、氯化銨、硫酸錳、硫酸鎂、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、硫酸亞鐵、氯化鈉和氯化鈣。

   1.1.4 儀器設備

控溫搖床、高壓蒸氣滅菌鍋、電子天平、pH測定儀、電熱恒溫培養箱、無菌操作臺和紫外分光光度計。

   1.2方法

   1.2.1 培養基的制備

(1)稱量

   按培養基配比依次準確地稱取酵母膏、NaCl、蛋白胨放入燒杯中，并在燒杯中加入少量蒸餾水。注：酵母膏常用玻棒挑取，放在小燒杯或表面皿中稱量，用熱水溶化后倒入燒杯，也可放在稱量紙上，稱量后直接放入水中，這時如稍微加熱，酵母膏便會與稱量紙分離，然后立即取出紙片。

(2)溶化

   可溶性淀粉溶液的配制方法：將所需克數的可溶性淀粉放入一個小燒杯中，加入少量蒸餾水，攪拌成糊狀，然后將糊狀溶液均勻倒入少于培養基總體積的沸水中，一邊攪拌一邊加熱，待其溶化成透明狀后繼續在電爐上加熱5分即制成可溶性淀粉溶液。 如果配制固體培養基時，將已準備好的可溶性淀粉溶液倒入燒杯中，將稱好的瓊脂放入已溶的藥品中，再加熱溶化，補水到所需的總體積。在制備用三角瓶盛固體培養基時，一般也可先將一定量的液體培養基分裝于三角瓶中，然后按2%的量將瓊脂直接分別加入各三角瓶中，不必加熱溶化，而是滅菌和加熱溶化同步進行，節省時間。 在瓊脂溶化過程中，應控制火力，以免培養基因沸騰而溢出容器。同時，需不斷攪拌，以防瓊脂糊底燒焦。配制培養基時，不能用銅或鐵鍋加熱溶化，以免離子進入培養基中，影響細菌生長。  

   (3)調pH培養基配好以后，先用精密pH試紙測量培養基的原始pH，如果偏酸，用滴管向培養基中逐滴加1mol/LNaOH，邊加邊攪拌，并隨時用pH試紙測其pH，直到pH達7為止；反之，用1mol/LHCl進行調節。 對于有些要求pH較精細的微生物，其pH的調節可用酸度計進行。 注意：pH不要調過頭，以避免回調而影響培養基內各離子的濃度，配制pH低的瓊脂培養基時，若預先調好pH并在高壓蒸汽下滅菌，則瓊脂因水解不能凝固，因此應將培養基的成分和瓊脂分開滅菌后再混合，或在中性pH條件下滅菌，再調整pH。

   (4)分裝 按照實驗要求，可將配置的培養基分裝入試管內或三角瓶中。 液體分裝：分裝的高度以試管高度的1/4左右為宜；分裝三角瓶的量則根據需要而定，一般以不超過三角瓶的一半為宜。 固體分裝：分裝于試管中的應不超過試管的1/5，滅菌后制成斜面；分裝三角瓶的量以不超過一半為宜。

   (5)加塞 培養基分裝完畢后，在試管口上塞上棉塞，以阻止外界微生物進入培養基內而造成污染，并保證有良好的通氣性能。

   (6)包扎加塞后，將全部試管用麻繩捆好，再在棉塞外包一層牛皮紙，以防止滅菌時冷凝水潤濕棉塞，外邊再用一道麻繩扎好。用記號筆注明培養基名稱，組別，配制日期。三角瓶加塞后，外包牛皮紙，用麻繩以活結扎好，使用時容易解開，同樣注明。

   (7)滅菌 將配置好且包扎完畢的固體、液體培養基及本實驗涉及的試管、三角瓶等及400ml純水于高壓滅菌器中以0.14Mpa，121℃條件下高壓蒸汽滅菌20分鐘。

   (8)斜面擱置 將培養基冷卻至50℃左右時放置斜面，斜面在試管的1/2處為宜，待斜面凝固后，放置于冰箱中待用。

   1.2.2菌種的篩選與保藏

   (1)倒平板 將實驗配制好的培養基加熱溶化，待冷卻至55—60℃時，倒平板9皿。

   (2)稀釋 用接種環取菌種，放入盛90ml無菌水的三角瓶中，振搖。用一支1ml無菌吸管吸取1ml菌液加入盛有9ml無菌水的大試管中充分混勻，然后用無菌吸管從此試管中吸取1ml加入另一盛有9ml無菌水的試管中，混合均勻，以此類推制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6不同稀釋度的菌液。

   (3)劃線  將平板底面分別用記號筆寫上10-4、10-5、10-6三種稀釋度（共三組）然后用接種環分別沾取濃度為10-    4、10-5、10-6稀釋液并對號在相應平板上劃線，室溫下靜止5—10min，使菌液吸附進培養基。

   (4)培養 將培養基平板倒置于37℃的電熱恒溫培養箱中，培養2—3天，觀察淀粉圈。對有淀粉圈的菌落，測量淀粉圈的直徑D，菌落直徑r，計算D/r的比值，可進行拍照，選擇淀粉圈較大的菌落作為后續實驗的菌種。

   (5)接種 接種到斜面培養基中，標注上日期等信息。放入電熱恒溫培養箱中培養作為一級種子。

   (6)保藏 斜面置于37℃的電熱恒溫培養箱中，培養2—3天，觀察菌種長勢好壞，若菌種長勢好則將其放入冰箱中保藏，若長勢不好則需多次斜面轉接。