亚洲中文久久精品无码WW16,亚洲国产精品久久久久爰色欲,人人妻人人澡人人爽欧美一区九九,亚洲码欧美码一区二区三区

       組織培養技術是在人為創造的無菌條件下將生物的離體器官（如根、莖、葉、莖段、原生質體）、組織或細胞置于培養基內，并放在適宜的環境中，進行連續培養以獲得細胞、組織或個體的技術。這種技術已廣泛應用于農業和生物、醫藥的研究。

       體內組織細胞在體外培養時，所需培養環境基本相似，但由于物種、個體遺傳背 景及所處發育階段等的不同，各自要求條件有一定差別，所采取的培養技術措施 亦不盡相同，現介紹主要組織細胞培養的要點如下：

       上皮細胞包括腺上皮是很多器官如肝、胰、乳腺等的功能成分，又由于癌起源于上皮組織，故上皮細胞培養特別受到重視。但上皮細胞培養中常混雜有成纖維細胞，培養時生長速度往往超過上皮細胞，并難以純化，同時上皮細胞難以在體外長期生存，因此純化和延長生存時間是培養關鍵。體內上皮細胞生長在膠原構成的基膜， 因此培養在有膠原的底物上可能利于生長， 另外人或小鼠表皮細胞培養在以 3T3 細胞為飼養層（用射線照射后）時，細胞易生長并可發生一定程度的分化現象。降低 PH、Ca2+含量和溫度，向培養基中加入表皮生長因子，均有利于表皮細胞生長。以表皮細胞為例，用皮膚表皮和真皮分離培養法可獲得純上皮細胞，

       內皮細胞易于從大血管分離培養成單層細胞，對于研究內皮細胞再生、腫瘤促血管生長因子（TAF）等有很大價值。       研究人內皮細胞培養以人臍帶靜脈灌流消化法尤為簡便，其法如下：

       1、產后新鮮臍帶，無菌剪取 10—15 厘米長一段，如不能立即培養，可于12小時內保存于 4℃。

       2、用三通注射器吸取溫 PBS 液注入臍靜脈中洗去殘血，在入口處用線繩扎緊， 以防液體返流。

       3、用血管鉗夾緊臍帶一端，從另一端向臍靜脈中徐徐注入濃度為 0.1%的粗制膠原酶，充滿血管，消化 3—10 分鐘；注入口用線繩扎，以防液體返流。

       4、吸出含有內皮細胞的消化液，于離心管中，注入溫PBS 輕輕反復沖洗后，一并注入離心管中（此步驟可重復） 。

       5、離心去上清，加入RPMI1640培養液制成細胞懸液，接種入培養器皿中，置溫箱培養。兩至三天可見細胞長成單層。

       神經細胞（神經元）不易培養，只有在適宜情況下，如接種在膠原底層上，或加入神經生長因子和膠質細胞因子時，可出現一定程度的分化，長出突起等現象， 但很難使之增殖。而神經膠質細胞是神經組織中比較容易培養的成分。人、鼠等腦組織即可用于神經膠質細胞培養，不僅能獲得生長的膠質細胞，也可形成能傳代的二倍體細胞系。一般說來，膠質細胞在培養中生長不穩定，不易自發轉化，但對外界因素仍保持很好的敏感性，可用 ROUS病毒和SV4等誘發轉化。

       一．設備：無菌操作設備。

       二．大型設備

CO2培養箱：恒溫5%、10%CO2維持培養液中pH值。        

倒置顯微鏡：用于每天觀察貼壁細胞生長情況。

解剖顯微鏡：用于準確地取材。

常溫冰箱：-4℃，用于保存各種培養液，解剖液和鼠尾膠。

低溫冰箱：-20℃--80℃，用于儲存血清酶，貴重物品和試劑。

電熱干烤箱：用于消毒玻璃器皿。高壓消毒鍋：用于消毒培養皿，手術器械。

過濾器：配制解剖液、培養液，必須過濾后才可使用，以去除細菌。

滲透壓儀：pH劑，天平等。

       三．培養器皿及手術器械

1.培養皿：常用35mm塑料及玻璃皿，解剖取材用15mm-90mm直徑。

2.培養板：24-40孔，可用于開放培養。

3.培養瓶；

4.吸管：常用1，5，10mL，均需泡酸、洗滌、滅菌后方可使用。

5.各類培養液貯存器。

6.小型手術器械。

       準備

       一.配制培養液

（1）解剖液：以無機鹽（去除Ca2+, Mg2+ ）加葡萄糖配制成PBS緩沖液，保持一定的滲透壓和pH值。

（2）基礎培養基（MEM）：主要為多種氨基酸，加入葡萄糖，雙蒸餾水溶解。

（3）接種培養液：用于胰酶消化后的細胞分散，做成細胞懸液，其成分為MEM含1%谷氨酰胺，另加入10%馬血清，當天配制。

（4）維持培養液：接種后24h，全部換成此液，后每2周換一次，每次換1/2。其成分為MEM中含5%馬血清，1%谷氨酰胺，及適量的支持性營養物質。

       二.培養基質

常用鼠尾膠、小牛皮膠，多聚賴氨酸，再涂膠。

       三.消毒培養皿的備用

所有培養器皿均需清水沖洗2-3d，達兩次ddH2O，每遍洗刷3-4次，加塞包裝，置于烤箱中干燥消毒，于培養前1天進行。

       神經細胞分散培養

       （一）選材

       常用胚胎動物或新生鼠神經組織。雞胚常用胚齡6-8d，新生鼠或胎鼠（12-14d）或人胚胎。不過也有認為與組織相關。如大白鼠胚胎以19d為宜，小鼠以18d為宜，大鼠紋狀體以10d為宜；若紋狀體與黑質聯合培養的大鼠胚，則黑質以13d，紋狀體18-21d為宜；小腦以20-21d小鼠胚胎，所獲蒲氏細胞成活率高，顆粒細胞正在分化；脊髓與DRG聯合培養，常用4-7d雞胚或12-14d小鼠胚胎，取材易，神經成活率高。

       （二）取材

       腦則取出相應組織，在解剖液中先剪碎，以使胰酶消化。脊髓則固定于瓊脂板上，用小刀將其要成背腹兩側，分別培養。

       （三）細胞分離與接種

       神經組織用0.125-0.25%胰蛋白酶在37℃孵育30min，移入接種液，停止消化，并洗去胰蛋白酶液，用細口吸管吹打細胞懸液，使其充分分散，如此多次，待沉淀后吸出上層細胞懸液，計數，預置細胞密度，接種于培養皿（1×106），做電生理應為5×105或更低。

       （四）抑制膠質細胞生長

培養3-5d后，也有人認為培養7d后，用阿糖胞苷，或5-FU抑制神經膠質細胞的生長