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化妝品防腐挑戰(zhàn)
即微生物挑戰(zhàn)性實(shí)驗(yàn)：將一定量的微生物加入到化妝品中，模擬化妝品中可能出現(xiàn)的污染情況，每隔一定時(shí)間對(duì)其中的活菌量進(jìn)行檢測(cè)，以活菌增減量判斷化妝品防腐體系效能的實(shí)驗(yàn)方法。
中和劑(neutralizer)
在微生物殺滅試驗(yàn)中，用以消除試驗(yàn)微生物與殺菌劑的混懸液中和微生物表面上殘留的殺菌劑，使其失去對(duì)微生物抑制和殺滅作用的試劑。
中和產(chǎn)物(product of neutralization)
指中和劑與殺菌劑作用后的產(chǎn)物。
儀器和設(shè)備
水浴鍋：48℃±2℃。 準(zhǔn)信息平臺(tái)
移液器：量程0.5yL~10L； 量程10pL~100uL； 量程100pL~1000piL及無(wú)菌吸頭。
無(wú)菌吸管，10.0mL(具0.1mL刻度)或移液器及吸頭。
離心機(jī)：2000g：
顯微鏡：
三角瓶(200mL)：
玻璃試管(18mm×180mm)：
恒溫培養(yǎng)箱：32.5℃±2.5℃22.5℃±2.5℃.
電子天平。
生物安全柜。
計(jì)時(shí)器。
比濁儀。
渦旋振蕩器。
試劑和材料
除另有規(guī)定外，所有試劑均為分析純或生化試劑。
實(shí)驗(yàn)用水：應(yīng)符合GB/T6682中一級(jí)水的規(guī)格。
磷酸鹽緩沖液(PBS) ：0.03mmol/L， pH 8.0.
營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基。
沙氏瓊脂培養(yǎng)基(SDA)
Eug on LT 100肉湯
/E中和肉湯(Dey/Engle y中和肉湯)
改良Le the en肉湯。
胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA)
試驗(yàn)菌株：金黃色葡萄球菌(ATCC 6538) 、大腸埃希氏菌(ATCC 25922) 、銅綠假單胞菌(ATCC15442) 、白色假絲酵母菌(ATCC 10231) 、黑曲霉菌(ATCC 16404) 。
操作步驟
菌液制備
白色假絲酵母菌菌液的制備：從保存好的試管斜面上(或菌種保存管中)取適量的菌體或菌種吸附小磁珠接種于沙氏葡萄糖瓊脂斜面，28℃±2℃，培養(yǎng)18-24h。用接種環(huán)取第1代培養(yǎng)物，劃線接種于SDA平板， 28*℃±2℃， 電熱恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)18-24h。挑取上述第2代培養(yǎng)物中典型菌落， 劃線接種于SDA瓊脂斜面， 28℃±2℃， 培養(yǎng)18-24h， 即為第3代培養(yǎng)物。吸取適量的無(wú)菌PBS緩沖液加入斜面試管內(nèi)，反復(fù)吹洗， 洗下菌苔.將洗液轉(zhuǎn)移至另一無(wú)菌試管中， 渦旋混勻20s。用PBS緩沖液將其稀釋成約1.0×10°cfu/mL~1.0×10'cfu/mL的菌懸液。制備好的菌懸液應(yīng)在2h內(nèi)使用， 或在2℃~8℃保存不超過(guò)24h。7.1.2銅綠假單胞菌＼金黃色葡萄球菌＼大腸桿菌菌液的制備：從保存好的試管斜面上(或菌種保存管中)取適量的菌體或菌種吸附小磁珠接種于胰蛋白胨大豆瓊脂斜面，36℃±1℃，培養(yǎng)18-24h。用接種環(huán)取第1代培養(yǎng)物， 劃線接種于TSA平板， 36℃±1℃℃， 培養(yǎng)18-24h。挑取上述第2代培養(yǎng)物中典型菌落， 劃線接種于TSA瓊脂斜面， 36℃±1℃℃， 培養(yǎng)18-24h， 即為第3代培養(yǎng)物。吸取適量的無(wú)菌生理鹽水加入斜面試管內(nèi)，反復(fù)吹洗，洗下菌苔。將洗液轉(zhuǎn)移至另一無(wú)菌試管中，渦旋混勻20s。用無(wú)菌生理鹽水將其稀釋成約1.0x 10'cfu/m~1.0x 10°cfu/mLL的菌懸液。制備好的菌懸液應(yīng)在2h內(nèi)使用，或在2℃~8℃保存不超過(guò)24h。
黑曲霉孢子懸液的制備：從保存好的試管斜面上(或菌種保存管中)取適量的菌體或菌種吸附小磁珠接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂斜面，22.5℃±2.5℃，培養(yǎng)7d-11d。吸取適量的無(wú)菌0.05%(v/v)吐溫
80生理鹽水加入斜面試管內(nèi)，刮洗黑曲霉分生孢子于溶液中。將孢子懸液轉(zhuǎn)移至裝有玻璃珠的無(wú)菌三角瓶中， 輕輕振搖1min后， 用無(wú)菌玻璃棉過(guò)濾除去菌絲。過(guò)濾后， 顯微鏡下(400倍) 觀察懸液中是否存在菌絲， 若懸液中有菌絲存在， 可經(jīng)2000g， 離心20min除去菌絲。再次在顯微鏡下觀察， 若仍有菌絲存在， 需再次離心。用無(wú)菌0.05%(v/v) 吐溫80生理鹽水將其稀釋成約1.0×10°cfu/mL~1.0X 10°cfu/mL的孢子懸液。制備好的孢子懸液應(yīng)當(dāng)天使用：或在2℃-8℃保存不超過(guò)2d， 使用前混合均勻并在顯微鏡下觀察是否有孢子出芽，若有孢子出芽，則棄之不用。
中和劑鑒定試驗(yàn)
每種試驗(yàn)菌株的中和劑鑒定試驗(yàn)應(yīng)分別進(jìn)行。
化學(xué)中和劑的選擇：為了中和化妝品中的防腐劑， 多采用D/E中和肉湯、Eug on LT 100液體培養(yǎng)基或者改良LE THE EN肉湯。若中和效果不理想， 可根據(jù)產(chǎn)品中添加的防腐劑類(lèi)型，進(jìn)行選擇。化學(xué)中和劑鑒定流程
將準(zhǔn)備的菌液10倍系列稀釋至濃度為1×10°cfu/mL的菌懸液， 用于中和鑒定試驗(yàn)。
將1g或1mL樣品加入到9mL中和劑中， *混勻， 室溫作用30±15min， 制成中和產(chǎn)物：若中和效果不理想， 可用中和劑作為稀釋液進(jìn)行二次倍比稀釋。將1mL稀釋液(PBS) 加入到9mL中和劑中， *混勻， 室溫作用30±15min， 作為對(duì)照組。
分別接種1mL7.2.3.1中制備的菌液至測(cè)試管(含10mL中和產(chǎn)物)和對(duì)照管中，渦旋混勻。同時(shí)接種1mL 7.2.3.1中制備的菌液至10mL稀釋液(PBS) 中， 作為陽(yáng)性對(duì)照組。
分別對(duì)測(cè)試組、對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組進(jìn)行平板計(jì)數(shù)，每個(gè)稀釋度進(jìn)行雙平行實(shí)驗(yàn)。細(xì)菌培養(yǎng)基為T(mén)SA， 36℃±1℃， 培養(yǎng)48h：白色假絲酵母菌培養(yǎng)基為SDA， 28℃±2℃， 培養(yǎng)48-72h。
對(duì)各組進(jìn)行計(jì)數(shù)， 測(cè)試組計(jì)數(shù)結(jié)果記作Nvf， 對(duì)照組計(jì)數(shù)結(jié)果記作Nvn， 陽(yáng)性對(duì)照組計(jì)數(shù)結(jié)果記作Nv。當(dāng)Nvn接近Nv， 并且Nvf≥0.5Nvn時(shí)， 認(rèn)為中和劑有效。
其余中和方法：除化學(xué)中和劑方法外，還可采用稀釋法、過(guò)濾沖洗法對(duì)產(chǎn)品中殘留的防腐劑進(jìn)行中和，具體操作方法可參照(消毒技術(shù)規(guī)范》(2002版)2.1.1.4.3。采用稀釋法時(shí)，應(yīng)采取適當(dāng)措施補(bǔ)償活菌回收率靈敏度的降低，以避免假陰性結(jié)果(例如，可采用膜過(guò)濾計(jì)數(shù)法代替稀釋液平板計(jì)數(shù)法)。挑戰(zhàn)試驗(yàn)
挑戰(zhàn)試驗(yàn)
每種試驗(yàn)菌株的殺菌試驗(yàn)應(yīng)分別進(jìn)行。
挑戰(zhàn)試驗(yàn)前應(yīng)該先按照《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》(2015版)第五章第2節(jié)“菌落總數(shù)檢驗(yàn)方法”對(duì)樣品進(jìn)行“菌落總數(shù)”檢測(cè)。
接種：取0.2mL7.1中制備的菌液，加入到裝有20g或20mL樣品的無(wú)菌塑料瓶中，*混合均勻。接種后的樣品置于22.5℃±2.5℃培養(yǎng)，分別在7，14，28天計(jì)數(shù)，分別計(jì)作Nx(X=7，14，28)。7.3.4計(jì)數(shù)：培養(yǎng)至特定時(shí)間后(7，14，21，28天)，取1mL或1g接種后的樣品，加入含有9mL無(wú)菌中和劑的試管中，充分渦旋混勻。(若中和劑鑒定試驗(yàn)中，對(duì)樣品進(jìn)行百倍稀釋后測(cè)定了中和劑的有效性， 則接種后的樣品進(jìn)行計(jì)數(shù)時(shí)也應(yīng)進(jìn)行百倍稀釋。) 室溫， 與中和劑作用30±15min后， 分別吸取1.0mL樣液于2個(gè)無(wú)菌平皿中進(jìn)行平板計(jì)數(shù)。如平板上生長(zhǎng)菌落數(shù)較多，可進(jìn)行10倍系列稀釋?zhuān)x擇合適的稀釋度進(jìn)行平板計(jì)數(shù)。每個(gè)稀釋度至少進(jìn)行雙平行計(jì)數(shù)。黑曲霉菌在22.5℃±2.5℃培養(yǎng)3-5d銅綠假單胞菌＼金黃色葡萄球菌＼大腸桿菌和白色假絲酵母菌在32.5℃±2.5℃培養(yǎng)48-72h。
選取菌落數(shù)在30-300cfu(細(xì)菌和白色假絲酵母菌) 或者15-150cfu(黑曲霉) 的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)，并按照Nx=C/(Vd)計(jì)算樣品中的活菌濃度(C代表計(jì)數(shù)平板上的菌落平均數(shù)：V代表計(jì)數(shù)平板上的加菌樣品接種量，一般為1mL：d代表計(jì)數(shù)平板對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù))。
除大腸桿菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、黑曲霉外，還可根據(jù)產(chǎn)品具體情況，增加特定的試驗(yàn)菌，該試驗(yàn)菌可以代表產(chǎn)品MAX可能受到的生物污染。比如，在高糖分口服制劑(口腔用品) 的防腐挑戰(zhàn)試驗(yàn)中， 推薦增加魯氏接合酵母N CYC 381。