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T4 DNA Ligase(Fast)
產品貨號：T5205-200U
儲存條件：-20℃
產品組成
組分 | 規格 |
T4 DNA Ligase(Fast)(5U/ul) | 40ul |
10×T4 DNA Ligase Buffer | 1ml |
50% PEG | 1ml |
注：1U=1 Weiss unit
產品簡介
T4 DNA Ligase(Fast)由攜帶T4噬菌體gene30的大腸桿菌產生。該酶催化雙螺旋DNA或RNA之間的5'-磷酸基團和3'-羥基之間形成磷酸二酯鍵。該酶在雙鏈DNA、RNA或者DNA/RNA復合物間可修復單鏈缺刻，并且可以連接有粘性末端或者平末端的DNA片段，但對于單鏈核酸無活性，主要用于限制性內切酶酶切產物DNA片段克隆、基因定點突變與PCR產物克隆、修復雙鏈DNA缺刻與線性DNA自環化。T4 DNA Ligase(Fast)需要ATP作為輔助因子，在室溫下完成粘性末端連接反應僅需10分鐘。
酶活單位定義
37℃條件下，1 Weiss unit的酶在20min內催化1nmol的[PPi]轉變為活性炭吸附態。1 Weiss unit等同于約200個粘性末端連接反應單位（CEU），相當于在16℃條件下，30min內連接50% HindIII消化后的λDNA片段。
酶活檢測條件
酶活在如下反應混合物中進行測試：66mM Tris-HCl(pH7.6)，6.6mM MgCl，0.066mM ATP，10mM DTT，3.3μM[32PPi]。
質量控制
核酸量內控切酶制殘留測試
37℃條件下，將200U的T4 DNA Ligase(Fast)與1ug的pUC19DNA中溫育4h，未檢測出共價閉合環狀DNA轉變為帶有缺刻的DNA。
核酸外切酶殘留檢測
將酶液與雙鏈DNA底物在37℃溫育16h，通過DNA電泳檢測雙鏈DNA底物無變化。
藍白斑測試
室溫條件下，使用30U T4 DNA Ligase連接pUC57 DNA/HindIII，pUC57 DNA/PstI或pUC57 DNA/SmaI消化產物1h，然后用E.coli XL1-Blue感受態細胞轉化連接產物，檢測到少于1%的白斑。
使用方法
1.DNA插入片段連接至載體DNA（粘性末端連接）
1）于冰上配制如下反應體系：
試劑 | 使用量 |
線性化載體DNA | 20~100ng |
插入片段DNA | 3:1~10:1（片段：載體摩爾比） |
10×T4 DNA Ligase Buffer | 2ul |
T4 DNA Ligase(Fast) | 1U(0.2ul) |
Nuclease-FreeWater | To 20ul |
2）充分混勻并瞬離，22℃溫育10min；
3）取1~5ul的連接產物用于50ul化學感受態細胞的轉化，或者取1~2ul用于50ul電轉感受態細胞的轉化。
注：如果連接反應產物用于電轉化，應使用離心柱或者氯仿抽提清潔DNA代替熱失活步驟。
2.DNA插入片段連接至載體DNA（平末端連接）
1）于冰上配制如下反應體系：
試劑 | 使用量 |
線性化載體DNA | 20~100ng |
插入片段DNA | 3:1~10:1（片段：載體摩爾比） |
10×T4 DNA Ligase Buffer | 2ul |
50% PEG | 2ul |
T4 DNA Ligase(Fast) | 5U(1ul) |
Nuclease-Free Water | To 20ul |
2）充分混勻并瞬離，22℃溫育1h；
3）取1~5ul的連接產物用于50ul化學感受態細胞的轉化，或者取1~2ul用于50ul電轉感受態細胞的轉化。
注：如果連接反應產物用于電轉化，應使用離心柱或者氯仿抽提清潔DNA代替熱失活步驟。
1. 線性DNA自環化
1）于冰上配制如下反應體系：
試劑 | 使用量 |
線性化DNA | 10~50ng |
10×T4 DNA Ligase Buffer | 5ul |
T4 DNA Ligase(Fast) | 5U(1ul) |
Nuclease-Free Water | To 50ul |
2）徹di混勻并瞬離，22℃溫育10min；
3）取1~5ul的連接產物用于50ul化學感受態細胞的轉化，或者取1~2ul用于50ul電轉感受態細胞的轉化。
注：如果連接反應產物用于電轉化，應使用離心柱或者氯仿抽提清潔DNA代替熱失活步驟。
2.接頭連接
雙鏈寡核苷酸接頭經常被用于在插入片段上產生粘性末端。接頭通常包含限制酶識別位點，在連接后經酶切處理產生和克隆載體匹配的粘端。有時候接頭已包含與克隆載體匹配的粘端，此時無需在接頭連接完成后進行插入片段的進一步處理。
1）于冰上配制如下反應體系：
試劑 | 使用量 |
線性化DNA | 100~500ng |
磷酸化接頭 | 1~2ug |
10×T4 DNA Ligase Buffer | 2ul |
50% PEG | 2ul |
T4 DNA Ligase(Fast) | 2U(0.4ul) |
Nuclease-Free Water | To 20ul |
2）徹di混勻并瞬離，22℃溫育10min；
3）在65℃作用10min或者70℃作用5min，進行熱失活。
注：添加1mM ATP的條件下，T4 DNA Ligase(Fast)在LabFD™酶切緩沖液中具有100%活性。因此，接頭連接反應時可以在LabFD™酶切緩沖液中進行，以簡化“接頭連接-酶切"實驗流程。具體方法為：接頭連接反應完成后，先失活T4 DNA Ligase，然后向該體系中添加ATP至終濃度1mM，再在體系中加入適量的LabFD™快速內切酶，最后使用最適酶切反應溫度進行溫育即可。
注意事項
1）T4 DNA Ligase在濃度高于200mM的NaCl或KCl中會被強烈抑制；
2）連接反應液添加量不應該超過感受態細胞體積的10%，不推薦體系中加入過量的T4 DNA Ligase；
3）與T4 DNA Ligase結合的DNA可能會在瓊脂糖凝膠中出現帶移或彌散，為了避免此現象，可以在上樣前對酶進行熱失活，必要時加入適量的SDS；
4）聚乙二醇（PEG）能極大地提高平末端連接的連接效率，PEG8000的推薦添加量是連接體系的5%（w/v）；
5）電轉化效率可能通過對T4 DNA Ligase熱失活或者使用離心柱或者氯仿抽提純化DNA方式來提高；
6）轉化子數目可通過延長反應時間至1h而增加。
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