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biotin-TUNEL細胞凋亡試劑盒
貨號：B0068
存儲條件：本產品應置于-20℃儲存，組分 A、E、G 需避光，避免反復凍融。有效期見外包裝。
注：組分 A、E、F、G 使用時請佩戴口罩、手套，接觸皮膚，請立即用大量水沖洗。
產品組分：
（20T） | （50T） | |
A.Biotin TUNEL Reaction Buffer | 1 mL | 2×1.25 mL |
B.TdT酶 | 20 μL | 50 μL |
C.Streptavidin-HRP | 20 μL | 50 μL |
D.Streptavidin-HRP稀釋液 | 1 mL | 2×1.25 mL |
E.DAB顯色液A | 100 μL | 250 μL |
F. AB顯色液B | 1 mL | 2×1.25 mL |
G. AB顯色液C | 50 μL | 125 μL |
H.Proteinase K (2 mg/mL) | 40 μL | 100 μL |
I.DNase I (2 U/μL) | 5 μL | 13 μL |
J.10 × DNase I Buffer | 100 μL | 260 μL |
產品簡介：
細胞凋亡的一個顯著特點是細胞染色體DNA 的降解， 這種降解非常特異并有規律，所產生的不同長度的DNA片段約為 180bp-200bp的整數倍，表現為瓊脂糖凝膠電泳中呈現特異的梯狀Ladder圖譜，本試劑盒采用TUNEL法，應用末端脫氧核糖核苷酸轉移酶（Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT）在凋亡細胞斷裂DNA的3′-OH末端催化摻入生wu素（Biotin）標記的dUTP (Biotin-X-dUTP)。隨后和辣根過氧化物酶 (HRP) 標記的Streptavidin(Streptavidin-HRP) 特異結合， 最后在 HRP 的催化下通過DAB 顯色來顯示凋亡細胞，從而可以通過普通光學顯微鏡觀察并計數凋亡細胞。由于正常的或正在增值的細胞幾乎沒有DNA的斷裂，因而沒有 3′-OH 形成，很少能被染色。TUNEL法可以選擇性的對凋亡細胞直接進行原位檢測，而非壞死細胞或因輻照和藥物治療而造成的DNA鏈斷裂的細胞，是一種更快速、直接的檢測手段。
使用方法：
實驗材料（自備）
PBS 緩沖液（pH~7.4）
4%多聚jia醛（PBS 配制）
PBS 配制 0.3% H2O2（新鮮配制）
70%乙醇（自選）
脫蠟溶劑（石蠟切片樣本）
注意事項：
1. 熒光物質均易發生淬滅，染色后的樣品宜避光保存。
2. 在使用DAPI熒光封片劑的情況下，雖然可減緩淬滅，仍需盡量避光。
3. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
實驗步驟
1.樣本準備：
（1）細胞樣品
a. 可選：準備一份陰性對照樣本（加入不含TdT酶的TUNEL反應液）。
b. PBS 清洗細胞兩次。
c. 細胞固定：加入適量4%多聚jia醛（pH 7.4）溶液，4℃放置30min。
d. PBS清洗細胞兩次。
e. 通透細胞：細胞可用配制于PBS中的0.2% Triton X-100溶液通透，室溫放置 20 min。
f. PBS清洗細胞兩次。
g.封閉細胞：每孔加入100μL左右的配制于PBS中的0.3% H2O2溶液，輕敲孔板使其充分覆蓋細胞，室溫避光封閉30min，用 1×PBS 清洗細胞 2 次；
（2）石蠟組織切片
a.室溫下用二甲苯浸泡石蠟組織切片2次，每次5 min， 以徹di脫掉石蠟。
注：二甲苯有毒，易揮發，請在通風櫥中進行此操作。
b.室溫下，將切片樣本浸沒于無水乙醇中漂洗2次，每次5 min。
c.室溫下，將切片樣本連續浸沒在不同濃度梯度的乙醇
（95%、90%、80%、70%）中，每種濃度各漂洗1次，每次5 min。
d.室溫下，將切片浸沒于純水中漂洗3 min，再將切片浸沒于1×PBS中漂洗3 min，用濾紙小心吸干切片樣本周圍液體。
e.用免疫組化筆圍描繪樣品輪廓，以便下游通透與標記。
f.按1: 100的比例，將2mg/mL的蛋白酶K溶液用1×PBS稀釋至終濃度20µg/mL，在每個樣本上滴加 100 µL，使溶液覆蓋全部樣本區域，室溫孵育20min（蛋白酶K的孵育時間、溫度需根據不同類型組織樣本進行優化）。
注：蛋白酶K可以幫助滲透組織，時間短達不到通透效果， 但延長孵育時間可能導致切片脫落。一般情況下，厚度4µm孵育10min，厚度30µm孵育30min。
g.PBS浸潤清洗切片兩次，每次5min。
h.封閉：加入適量配制于PBS中的0.3% H2O2溶液（新鮮配制），室溫孵育30 min，以滅活切片內源的過氧化氫酶。
i.PBS浸潤清洗切片兩次，每次 5 min，用濾紙吸去多余的液體，將處理好的樣品放在濕盒中保持濕潤。
（3）冰凍組織切片
a.將冰凍切片放置于室溫的片架上，室溫20 min，晾干。
b.將載玻片浸沒在4%多聚jia醛溶液中，室溫固定30 min。
c.PBS浸潤清洗切片兩次，每次5 min。
d.用濾紙小心吸干載玻片上樣本周圍的液體。
e.按1:100的比例，將2 mg/mL 的蛋白酶K溶液用1×PBS 稀釋至終濃度20 µg/mL。每個樣本上滴加 100 µL，使溶液覆蓋全部樣本區域，室溫孵育10min（Proteinase K 的孵育時間、溫度需根據不同類型組織樣本進行優化）。
注：蛋白酶 K 可以幫助滲透組織，時間短達不到通透效果， 但延長孵育時間可能導致切片脫落。一般情況下，厚度4 µm孵育10 min，厚度30 µm 孵育30 min。
f.PBS 浸潤清洗切片兩次，每次 5 min。
g.封閉：加入適量配制于PBS中的0.3% H2O2 溶液（新鮮配制），室溫孵育30 min，以滅活切片內源的過氧化氫酶。
h.PBS清洗樣品3次，每次5min，用濾紙吸去多余的液體，將處理好的樣品放在濕盒中保持濕潤。
（4）陽性處理（僅陽性對照進行此步驟，其他樣品直接進行TUNEL反應步驟）
a.按1:10的比例用 ddH2O 將10×DNase I Buffer 稀釋成1×DNase I Buffer 備用。
b.滴加100 µL 1×DNase I Buffer 到已通透的樣本上，室溫平衡5 min。
c.用1×DNase I Buffer以1:100稀釋DNase I (2 U/μL)，使其為終濃度20 U/mL 的工作液。
d.輕輕吸掉多余液體，加入100μL濃度為20 U/mL DNase I工作液，室溫孵育10min。
e.輕輕吸掉多余液體，PBS 清洗樣品2次。
2.TUNEL 反應
（1）配制TUNEL 反應液（即用即配）：
1 個樣品 | 5 個樣品 | 10 個樣品 | |
TdT 酶 | 1 μL | 5 μL | 10 μL |
Biotin TUNEL Reaction Buffer |
49 μL |
245 μL |
490 μL |
TUNEL 反應液總體積 |
50 μL |
250 μL |
500 μL |
（2）每個樣本加入 50 μL TUNEL 反應液，使反應液均勻覆蓋樣本。37℃孵育 60 min。
注：50μL TUNEL 反應液適合涂片、切片或 96 孔板（其他不同孔板可以適當調整 TUNEL 反應液體積，覆蓋細胞即可）。
如果待檢測的樣品為涂片、切片或在 24 孔板、12 孔板或 6 孔板中，可以使用防蒸發膜，或自行嘗試使用自封袋或者其它適當材料自行裁剪成比孔略小的圓形塑料片，滴加 TUNEL 反應液后覆蓋在樣本上，可以防止 TUNEL 反應液蒸發，并且使TUNEL 反應液均勻覆蓋樣本。
（3）棄去 TUNEL 反應液，PBS 清洗 2 次。
3. Streptavidin-HRP工作液和DAB顯色液的配制
（1）Streptavidin-HRP 工作液的配制（即用即配）：
1個樣品 | 5個樣品 | 10個樣品 | |
Streptavidin-HRP | 1 μL | 5μL | 10μL |
Streptavidin-HRP稀釋液 | 49 μL | 245μL | 490μL |
Streptavidin-HRP工作液總體積 | 50 μL | 250μL | 500μL |
（2）DAB 顯色液的配制（即用即配）：
1個樣品 | 5個樣品 | 10個樣品 | |
DAB顯色液A | 5μL | 25μL | 50μL |
DAB顯色液B | 42.5μL | 212.5μL | 425μL |
DAB顯色液C | 2.5μL | 12.5μL | 25μL |
DAB 顯色液總體積 | 50μL | 250μL | 500μL |
4. 樣品顯色
（1）向樣品滴加50μL Streptavidin-HRP工作液，37℃避光 孵育30 min。
注：50 μL Streptavidin-HRP 工作液適合涂片、切片或 96 孔 板、48 孔板、24 孔板或 12 孔板的一個孔，如果是 6 孔板， 建議使用 100 μL。為防止 Streptavidin-HRP 工作液蒸發，建議在樣品上覆上防蒸發膜。
（2）PBS清洗樣品3次，每次5min。
（3）向樣品滴加50μL DAB 顯色液，室溫孵育5-30 min或在顯微鏡下根據顏色的發展情況掌握染色時間。 注：如果顯色很強可短于 5 min 即停止顯色，如果顯色很弱， 可以適當延長顯色時間，甚至顯色過夜。
（4）PBS 清洗樣品3次，每次5 min。
（5）選做：用蘇mu素染色液或甲基綠染色液進行細胞核染色。隨后用PBS清洗 3 次。
（6）直接光學顯微鏡下觀察。針對石蠟切片，如果需要封片，使用95%乙醇脫水5 min，再用100%乙醇脫水2次， 每次3min，再用二甲苯透明2次，每次5min。
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