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  CyDye mono-reactive NHS Esters (菁染料琥珀酰亞胺酯)

1.產品簡介

菁染料是性能優良的熒光標記染料，摩爾吸光系數在熒光染料中是最高的，其琥珀酰亞胺 酯是zui常用的脂 肪氨基標記試劑，廣泛用于蛋白、抗體、核酸及其他生物分子的標記和檢測。 通過改變次甲基鏈的長度，可改 變其熒光發射波長，每增加一個雙鍵，按照 Huoffman 規則正 好紅移約 100nm。 菁染料 Cy3 和 Cy5 已成為基因芯片的首xuan熒光標記物；另外,Cy5, Cy5.5 和 Cy7 的吸收在近紅外區背 景非常 低，是熒光強度最高、zui穩定的長波長染料。特別適合于活體小動物體內成像代替放射性元素。但 由于菁染 料，尤其是不對稱菁染料的合成副反應多，副產物極性相近，產物的分離提純相當困難。菁染料 特別是水溶性菁 染料分子極性大，分離提純越加困難。

表 1.菁染料琥珀酰亞胺酯的性質參數

2. 操作步驟

2.1 水溶性 Cy3 NHS 標記 anti-GST 多克隆抗體

市場上買到的抗體如果含有其它蛋白(例如 serum albumin 或 gelatin 等)或帶氨基的緩沖液會影響標記, 在標記前需純化。

1.在 1 L 0.15 M NaCI 溶液中透析 anti-GST 抗體(濃度為 0.5 mL at 3 mg/mL),常溫透析 4 小時。

2.在 4°C 用新鮮的 1 L 0.15 M NaCI 溶液再透析過夜。

3. 第二天用 1 L 0.1 M NaHCOs (pH 8.3)透析 4 小時。

4. 用 0.22 卩 m 注射器過濾頭過濾抗體溶液。

5.用 0.1 M NaHCOs 稀釋少量的抗體，在 280nm 處測其紫外吸收值計算標記抗體的總量(IgG antibody 摩爾 吸光系數 170 000 cm" at 280 nm).

6.用 DMS。配置 Cy3 NHS (MW 765.95)溶液濃度為 10 mg/mL；計算所需體積以得到想要的 CyDye NHS 和抗體的比值(例如 20:1),然后慢慢'壽其入到抗體溶液中，同時在暗處常溫緩慢攪 拌 45 分鐘。

7.用 1 L 0.15 M NaCI 溶液常溫避光透析 4 小時除去未標記上的 Cy3。

8.在 4°C 用新鮮的 1 L 0.15 M NaCI 溶液再避光透析過夜。

9.用 1 L of 0.01 M PBS/ 0.01%疊dan化na溶液常溫避光透析 4 小時，在 4°C 常溫避光再次透析 過夜。

10.用 0.22 卩 m 注射器過濾頭過濾抗體溶液。

11.用 0.01 M PBS/0.01 %疊dan化na整數倍稀釋標記抗體溶液，測量 280nm (蛋白)和 552nm (Cy) 處的紫 外可見吸光度。

12.產品冷凍干燥成粉末或在 0.01 M PBS/ 0.01%疊dan化na溶液中，-20°C 避光儲存。

2.2 水溶性 Cy5 NHS 標記

1. Cy5 NHS 1.0 mg 溶解于 400 pL DMS。后，加入到 1mL 的玻璃瓶中盛有 (D-seQ-leucine-enkephalin acetate (YSGFLT, 0.75 mg)的 400 pL DMS。溶液。(Dye 和 peptide 投料比是 1:1)

2. 然后加入 15 卩 L 三乙胺，常溫避光攪拌反應混合物過夜。

3. 用 HPLC 純化蛋白，使用蛋白 C18 柱子(25cmx10mm),每次上樣注入 2x400 卩 L, 30 分鐘 梯度洗脫從 0.1% TFA 水溶液到 MeCN：HQ (0.1% TFA) =70：30,流速 4mL/min°(對不同的 蛋白選擇不同的合 適 HPL C 梯度流動相)

4. 收集適當的色帶峰，標記多肽的保留時間比未標記的多肽長。

5. 產品冷凍干燥成粉末或在水溶液中，-20°C 避光儲存；必要肘可用質譜表征。

6. CyDye 標記的蛋白穩定性取決于蛋白本身。例如標記的 IgG 在 4 °C 可避光保存 2 月；更長 期的保存需加入等 體積的甘油-20 °C 避光保存。

2.3 水溶性 CyDye SE 標記

氨基封端的 OLIGO 可以標記 CyDyeSE,但是非常困難；標記前因為 OILGO 經氨水脫保護， 請務必洗滌掉 所有的殘余氨水。然后將樣品真空干燥；然后溶于 0.25 ml 的 0.5 M NaCI 溶液 中，用 Sephadex G-50 脫 鹽，用 5.0 mM borate 緩沖液平衡到 pH=8.0,然后用以上硼酸緩沖液 沖下 OLIGO。然后濃縮至干的樣品溶于 0.1 M carbonate buffer (pH 8.5-9.0)；在 0.5mL 碳酸 緩沖液中 30 nmoles 的。LIGO 加入到 CyDye SE 的玻璃 瓶中室溫避光，密閉攪拌反應 60min。 反應物經 Sephadex G-50 或 RP-HPLC 過柱純化，冷凍干燥后避光保存。

注意：Oligonucleotides 和 oligopeptides 由于太小會留在過濾膜上或在凍存管內貼壁成膜，無法標記。

2.4 活體成像領域

SPF 級 BALB/C 裸鼠，6-8 周齡，18-20 克，實驗前 24 h 自由進食、飲水。

于實驗裸鼠腹腔內注射 2%戊巴bi妥鈉 300^(215 mg/ kg)麻醉動物。將裸鼠俯臥位平放于小動物多光譜活 體成像系統的記錄暗箱中。實驗時將 Cy7 或 Cy7 標記的生物分子或藥物 DMSO 稀釋后，于裸鼠尾靜脈注射 200pL( 0.5 mg/g)［最佳用量和時間需要客戶根據自己的儀器和藥 物試劑等條件優化］，每 5min 記錄 1 張動物 在體內發射熒光的成像圖片，分析

熒光藥物的分 布情況。對照鼠不注射藥物，進行同時記錄。記錄結束后迅速 解剖裸鼠的心、

肝、脾、肺、腎 等臟器，進行成像。

Cy7 檢測時激發波長 700?770 nm 帶通，發射波長 790 nm 長通。液晶可調諧濾光片掃描 范圍 780?950 nm，掃描步進 10 nm。曝光時間為 500 ms。

不同的藥物代謝時間不一樣，注射入裸鼠體內，熒光立即分布全身，然后逐歩向膀胱聚集， 呈現顯著的腎 排泄的特點一般 4~6 小時，快得只有 30 分鐘；如果是骨骼等部位靶尋的 Cy7 標 記藥物，有客戶反映一周后 活體成像系統仍能檢測到熒光成像。

器官切片觀察：將解剖的器官迅速放置于 4%多聚甲醪也不 4 小時以上，0%, 20%, 30%PBS 蔗糖依次 沉底，20 卩 m 切片，多聚賴氨酸洗過的載玻片貼片，B 応干，DAP'染色。共聚焦 顯微鏡觀察，激光器為氨氤 633 nm。

穩定性與儲存：

未幵封的粉末在避光干燥-20°C 存放 12 月。CyDye NHS 水溶液現配現用不能儲存。任何 溶解后的 CyDye NHS 粉末最好立即使用；無水 h；DMSO 瞥/- 20°C 保存最多 2 個星期。

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