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細胞增殖-毒性檢測試劑盒 Cell Counting Kit-8(CCK-8)
產品貨號：CK001
儲存條件：CCK-8溶液在避光，0-5℃的條件下可以保存一年； -20℃下保存2年；如需經常使用請將試劑存放在0-5℃，為防止背景值增加干擾實驗結果，請勿反復凍融。
CCK-8試劑使用方法
一、通用操作步驟
1. 在96孔板每孔加入100uL細胞懸液； 2.在培養箱中預培養細胞；3.向培養板中加入藥物(如果不加藥物，直接進行第五步操作)；4.在培養箱中培養一段時間；5. 向每孔加入10 μL的CCK溶液；6. 將培養板在培養箱內孵育1～4小時(根據具體實驗優化)。7. 用酶標儀測定在450nm處的吸光度
二、制作標準曲線（測定細胞具體數量時）
1、先用細胞計數板計數所制備的細胞懸液中的細胞數量，然后接種細胞。
2、按比例(例如:1/2比例)依次用培養基等比稀釋成一個細胞濃度梯度，一般要做3-5個細胞濃度梯度，每組3-6個復孔。
3、接種后培養2-4小時使細胞貼壁，然后加CCK試劑培養一定時間后測定OD值，制作出一條以細胞數量為橫坐標(X軸)，OD值為縱坐標 (Y軸)的標準曲線。根據此標準曲線可以測定出未知樣品的細胞數量(用此標準曲線的前提條件是實驗的條件要一致，便于確定細胞的接種數量以及加入CCK后的培養時間)
三、細胞活性檢測
1、在96孔板中接種細胞懸液（100μL/孔）。將培養板放在培養箱中預培養（在37 °C,5% CO2的條件下）。
2、向每孔加入10 μL的CCK溶液（注意不要在孔中生成氣泡，它們會影響OD值的讀數）。
3、將培養板在培養箱內孵育1-4小時。
4、用酶標儀測定在450nm處的吸光度。
5、如果暫時不測定OD值，打算以后測定的話，可以向每孔中加入10 μL 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液，并遮蓋培養板避光保存在室溫條件下。在24小時內吸光度不會發生變化。
四、細胞增值-毒性檢測
使用方法（以96孔板為例，其他規格培養板按實際情況安排）：
1、在96孔板中配置100μl的細胞懸液（通常細胞增殖實驗每孔加入100μl 2000個細胞，細胞毒性實驗每孔加入100μl5000個細胞。具體每孔所用的細胞的數目，需根據細胞的大小，細胞增殖速度的快慢等因素決定）。按照實驗需要，進行培養（在37 °C，5%CO2,，的條件下）預培養24小時。
2、向培養板加入1-10μl不同濃度的待測藥物刺激。
3、將培養板在培養箱孵育一段適當的時間（后面有具體細胞的建議時間，例如：6、12、24或48小時）。
4、每孔加入10μlCCK-8溶液（注意不要在孔中生成氣泡，它們會影響OD值的讀數）。如果起始的培養體積為200μl，則需加入20μl CCK-8溶液，其他情況以此類推。可以用加了相應量細胞培養液和CCK-8溶液但沒有加入細胞的孔作空白對照。如果擔心所使用的藥物會干擾檢測，需設置加了相應量細胞培養液、藥物和CCK-8溶液但沒有加入細胞的孔作為空白對照。
5、在細胞培養箱內繼續孵育1-4小時，對于大多數情況孵育1小時就可以了。時間的長短根據細胞的類型和細胞的密度等實驗情況而定，初次實驗時可以在0.5、1、2和4小時候分別用酶標儀檢測，然后選取吸光度范圍比較適宜的一個時間點用于后續實驗。
6、用酶標儀測定在450nm處的吸光度，如無450nm濾光片，可以使用420-480nm的濾光片。可以使用大于600nm的波長，例如650nm，作為參考波長進行雙波長測定。
7、如果暫時不測定OD值，打算以后測定的話，可以向每孔中加入10μl 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液，并遮蓋培養板避光保存在室溫條件下。在24小時內吸光度不會發生變化。
8、注意：如果待測物質有氧化性或還原性的話，可在加CCK之前更換新鮮培養基（除去培養基，并用培養基洗滌細胞兩次，然后加入新的培養基），去掉藥物影響。當然藥物影響比較小的情況下，可以不更換培養基，直接扣除培養基中加入藥物后的空白吸收即可。
活力計算： 細胞活力*（％）=[A(加藥)-A（空白）]/[A（0加藥）-A（空白）] ×100
A（加藥）：具有細胞、CCK溶液和藥物溶液的孔的吸光度
A（空白）：具有培養基和CCK溶液而沒有細胞的孔的吸光度
A（0加藥）：具有細胞、CCK溶液而沒有藥物溶液的孔的吸光度
*細胞活力：細胞增殖活力或細胞毒性活力
注意事項：
1、由于使用96孔板進行檢測，如果細胞培養時間較長，一定要注意蒸發的問題。一方面，由于96孔板周圍一圈最容易蒸發，可以采取棄用周圍一圈的辦法，改加PBS，水或培養液；另一方面，可以把96孔板置于靠近培養箱內水源的地方，以緩解蒸發。
2、CCK-8檢測細胞活性的原理是通過檢測活細胞脫氫酶催化的反應。任何待測體系中存在還原劑，例如一些抗氧化劑會干擾檢測，需設法去除。如果待測物質有氧化性或還原性的話，可在加CCK-8之前更換新鮮培養基，去掉藥物的影響。當然藥物影響比較小的情況可以不更換培養基，直接扣除培養基中加入藥物后的空白吸收即可。
3、建議先做幾個孔摸索接種細胞的數量和加入CCK-8試劑后的培養時間。
4、建議采用多通道移液器，可以減少平行孔間的差異。加入CCK試劑時，建議斜貼著培養板壁加，不要查到培養基液面下加樣，溶液產生氣泡，會干擾OD值讀數。
5、當使用標準96孔板時，貼壁細胞的最小接種量至少為1000個/孔（100μl培養基）。檢測白細胞時的靈敏度相對較低，因此推薦接種量不低于2500個/孔，（100μl培養基），且培養時間長一些。如果要使用24孔板或6孔板實驗，請先計算每孔相應的接種量，并按照每孔培養基總體積的10%加入CCK-8溶液。
6、加入CCK-8溶液時，如果細胞培養時間較長，培養基顏色已變化或PH值變化。建議換用新鮮的培養基。
7、如果沒有450nm的濾光片，可以使用吸光度在430-490nm之間的濾光片，但是450nm濾光片的檢測靈敏度最高。
8、酚紅和血清對本試劑盒的測定無明顯影響。培養基中酚紅的吸光度可以在計算時，通過扣除空白孔中本底的吸光度而消去，因此不會對檢測造成影響。
9、為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
CCK-8 試劑參考實驗數據
（此數據僅供參考，建議預先摸索良好實驗條件）
細胞種類 | 接種細胞數量 | 培養板 | 培養基名稱 | 培養基體積 | CCK-8試劑量 | 加入CCK培養時間 | ||
1 | A549（人肺癌） | 貼壁 | 8000/孔 | 96 | DMEM | 100ul/孔 | 10ul/孔 | 2-3hr. |
2 | AGS | 貼壁 | 10000/孔 | 96 | F12 | 100ul/孔 | 10ul/孔 | 2hr. |
3 | ASTC-a-1 | 貼壁 | 50000/孔 | 96 | RPMI1640 | 100ul/孔 | 10ul/孔 | 3.5hr. |
4 | B16（黑色素瘤） | 貼壁 | 4000孔 | 96 | DMEM | 100ul/孔 | 10ul/孔 | 3hr. |
5 | Balb/c 3T3 | 貼壁 | 10000孔 | 96 | RPMI1640 | 100ul/孔 | 10ul/孔 | 4hr. |
6 | Bcap-37（人乳腺癌） | 貼壁 | 5000孔 | 96 | RPMI1640 | 100ul/孔 | 10ul/孔 | 4hr. |
7 | Bel-7402 （人肝癌） | 貼壁 | 5000孔 | 96 | DMEM | 100ul/孔 | 10ul/孔 | 2hr. |
8 | CTLL-2 | 懸浮 | 10000孔 | 96 | RPMI1640 | 100ul/孔 | 10ul/孔 | 3hr. |
9 | EaHY926 | 貼壁 | 20000/孔 | 96 | DMEM | 100ul/孔 | 10ul/孔 | 2hr. |
10 | ECV340（人臍靜脈血管內皮細胞） | 貼壁 | 20000/孔 | 96 | DMEM | 100ul/孔 | 10ul/孔 | 2hr. |
11 | HaCaT | 貼壁 | 10000/孔 | 96 | DMEM | 100ul/孔 | 10ul/孔 | 4hr. |
12 | HAEC | 貼壁 | 10000/孔 | 96 | RPMI1640 | 100ul/孔 | 10ul/孔 | 4hr. |
13 | HEK-293 | 貼壁 | 5000/孔 | 96 | DMEM | 100ul/孔 | 10ul/孔 | 2hr. |
14 | HepG2（人肝細胞癌） | 貼壁 | 2000/孔 | 96 | DMEM,10%FCS | 100ul/孔 | 10ul/孔 | 2hr. |
15 | Hela（人宮頸癌） | 貼壁 | 2000-25000/孔 | 96 | MEM,10%FCS, L-glutamine | 100ul/孔 | 10ul/孔 | 2hr. |
16 | Ho-8910（人卵巢癌） | 貼壁 | 80000/孔 | 96 | DMEM | 100ul/孔 | 10ul/孔 | 3hr. |
17 | HL60（人原髓細胞白血病） | 懸浮 | 30000-45000/孔 | 96 | RPMI1640 | 100ul/孔 | 10ul/孔 | 3hr. |
18 | HLF | 貼壁 | 10000/孔 | 96 | DMEM | 100ul/孔 | 10ul/孔 | 1hr. |
19 | HS 766T（人胰腺癌細胞） | 貼壁 | 100000/孔 | 96 | RPMI1640 | 100ul/孔 | 10ul/孔 | 2hr. |
20 | Huh7 | 貼壁 | 100000/孔 | 96 | DMEM | 100ul/孔 | 10ul/孔 | 2hr. |
21 | HUVEC | 貼壁 | 5000/孔 | 96 | RPMI1640 | 100ul/孔 | 10ul/孔 | 4hr. |
22 | Hepatocytes(肝細胞) | 貼壁 | 30000/孔 | 96 | DMEM | 100ul/孔 | 10ul/孔 | 2-3hr. |
23 | HSC | 懸浮 | 10000/孔 | 96 | DMEM | 100ul/孔 | 10ul/孔 | 3hr. |
24 | K562 | 懸浮 | 40000/孔 | 96 | RPMI1640 | 100ul/孔 | 10ul/孔 | 6hr. |
25 | L1210（小鼠淋巴白血病） | 懸浮 | 200000/孔 | 96 | RPMI1640 | 100ul/孔 | 10ul/孔 | 3hr. |
26 | L929(小鼠成纖維細胞株) | 貼壁 | 1000/孔 | 96 | DMEM | 100ul/孔 | 10ul/孔 | 4hr. |
27 | MCF-7(人乳腺腺癌) | 貼壁 | 10000/孔 | 96 | RPMI1640+10%小牛血清 | 100ul/孔 | 10ul/孔 | 2-3hr. |
28 | MN9D | 貼壁 | 5000/孔 | 96 | DMEM/F12（1:1） | 100ul/孔 | 10ul/孔 | 4hr. |
29 | NIH3T3 | 貼壁 | 10000/孔 | 96 | DMEM | 100ul/孔 | 10ul/孔 | 1-2hr. |
30 | NRK（大鼠腎細胞） | 貼壁 | 5000/孔 | 96 | DMEM+10%小牛血清L- glutamine | 100ul/孔 | 10ul/孔 | 4hr. |
31 | P815 | 懸浮 | 10000/孔 | 96 | RPMI1640 | 100ul/孔 | 10ul/孔 | 3hr. |
32 | PC12 | 貼壁 | 10000/孔 | 96 | RPMI1640 | 100ul/孔 | 10ul/孔 | 3-4hr. |
33 | （人膽管癌細胞系）QBC939 | 貼壁 | 5000/孔 | 96 | RPMI1640+10%TBS | 100ul/孔 | 10ul/孔 | 4hr. |
34 | Raji（人 Burkitt’s 淋巴瘤） | 懸浮 | 100000/孔 | 96 | RPMI1640 | 100ul/孔 | 10ul/孔 | 5hr. |
35 | RAW264.7（小鼠巨噬細胞） | 貼壁 | 20000/孔 | 96 | DMEM | 100ul/孔 | 10ul/孔 | 2hr. |
36 | SD大鼠脾淋巴細胞 | 懸浮 | 3×105-4×105/孔 | 96 | RPMI1640+10%BSA | 200ul/孔 | 10ul/孔 | 4hr. |
37 | SGC-996 | 貼壁 | 150000/孔 | 96 | DMEM | 100ul/孔 | 10ul/孔 | 2hr. |
38 | SH-SY5Y | 懸浮 | 12000/孔 | 96 | DMEM | 100ul/孔 | 10ul/孔 | 3hr. |
39 | SK | 貼壁 | 80000/孔 | 96 | DMEM | 500ul/孔 | 50ul/孔 | 3hr. |
40 | SMC | 貼壁 | 20000/孔 | 96 | DMEM | 200ul/孔 | 10ul/孔 | 4hr. |
41 | SMMC-7721（人肝癌） | 貼壁 | 1000/孔 | 96 | DMEM,10%FCS | 100ul/孔 | 10ul/孔 | 2hr. |
42 | SPC-A1 （肺腺癌） | 貼壁 | 3000/孔 | 96 | RPMI1640 | 100ul/孔 | 10ul/孔 | 3hr. |
43 | SW480 | 貼壁 | 1000/孔 | 96 | DMEM | 100ul/孔 | 10ul/孔 | 2hr. |
44 | T-24（人膀胱變異細胞癌） | 貼壁 | 80000/孔 | 96 | DMEM | 180ul/孔 | 10ul/孔 | 3hr. |
45 | Tca8113 | 貼壁 | 10000000/孔 | 96 | RPMI1640 | 100ul/孔 | 10ul/孔 | 4hr. |
46 | T淋巴細胞 | 懸浮 | 1×104-1×106/孔 | 96 | RPMI1640 | 100ul/孔 | 10ul/孔 | 2hr. |
47 | U937 | 懸浮 | 200000/孔 | 96 | RPMI1640 | 100ul/孔 | 10ul/孔 | 3hr. |
48 | Vero E6 | 貼壁 | 30000/孔 | 96 | RPMI1640(10%FBS) | 100ul/孔 | 10ul/孔 | 2hr. |
49 | Wish細胞（人羊膜細胞） | 貼壁 | 30000/孔 | 96 | 5%BCS MEM | 100ul/孔 | 10ul/孔 | 2hr. |
50 | 7901 | 貼壁 | 15000-20000/孔 | 96 | RPMI1640 | 100ul/孔 | 10ul/孔 | 4hr. |
51 | 成纖維細胞 | 貼壁 | 1500/孔 | 96 | RPMI1640 | 100ul/孔 | 10ul/孔 | 3hr. |
52 | 大鼠系膜細胞 | 貼壁 | 10000/孔 | 96 | DMEM | 100ul/孔 | 10ul/孔 | 2hr. |
53 | 骨髓間充質干細胞 | 貼壁 | 4000/孔 | 96 | RPMI1640 | 100ul/孔 | 10ul/孔 | 3hr. |
54 | 結腸癌Caco-2細胞 | 貼壁 | 10000/孔 | 96 | DMEM | 100ul/孔 | 10ul/孔 | 3hr. |
55 | 乳鼠心肌細胞 | 貼壁 | 10000/孔 | 96 | DMEM | 100ul/孔 | 10ul/孔 | 0.5-3hr. |
56 | 人成骨細胞 | 貼壁 | 5000/孔 | 96 | DMEM-LG成骨細胞誘導培養液 | 100ul/孔 | 10ul/孔 | 3hr. |
57 | 人外周血淋巴細胞 | 懸浮 | 50000/孔 | 96 | DMEM | 100ul/孔 | 10ul/孔 | 4hr. |
58 | 人支氣管上皮細胞 | 貼壁 | 2000/孔 | 96 | LHC-8無血清培養基 | 100ul/孔 | 10ul/孔 | 4hr. |
59 | 神經母細胞瘤 | 貼壁 | 10000/孔 | 96 | MEM | 100ul/孔 | 10ul/孔 | 2hr. |
60 | 腎小球系膜細胞 | 貼壁 | 1000/孔 | 96 | DMEM | 100ul/孔 | 10ul/孔 | 1hr. |
61 | 樹突狀細胞 | 懸浮 | 1000000/孔 | 96 | RPMI1640 | 100ul/孔 | 10ul/孔 | 4.5hr. |
62 | 兔軟骨細胞 | 貼壁 | 1000/孔 | 96 | DMEM | 100ul/孔 | 10ul/孔 | 3-4hr. |
63 | 小鼠脾臟T淋巴細胞 | 懸浮 | 2000000/孔 | 96 | RPMI1640 | 100ul/孔 | 10ul/孔 | 4hr. |
64 | 原代大鼠肝臟細胞 | 貼壁 | 30000/孔 | 96 | DMEM/F12(1:1) | 100ul/孔 | 10ul/孔 | 3-4hr. |
65 | 原代胃癌細胞 | 貼壁 | 10000/孔 | 96 | RPMI1640人 | 100ul/孔 | 10ul/孔 | 4hr. |
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