All-in-One First-Strand Synthesis MasterMix (with dsDNase)

貨號：F0202

儲存條件：-20℃

產(chǎn)品簡介：

All-in-One First-Strand Synthesis MasterMix是一款高效、便捷、減少污染的高質(zhì)量一鏈cDNA合成試劑盒，包含M-MLV GIII Reverse Transcriptase及其反應(yīng)Buffer、RNA酶抑制劑、dNTPs, Oligo(dT)₂₀VN和隨機(jī)引物等一鏈cDNA合成所需的所有組分，僅需加入RNA模板和水即可開始反應(yīng)。使用該逆轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得的cDNA，下游可用于qPCR、普通PCR等實(shí)驗(yàn)。

本試劑盒采用dsDNase高效去除基因組DNA污染，區(qū)別于常規(guī)的DNase l, dsDNase 能夠特異性的消化雙鏈DNA (dsDNA以及DNA與RNA的雜合鏈)，并且具有熱敏感性，可在高溫條件下快速不可逆地失活。與傳統(tǒng)使用DNase l去除基因組DNA污染的方法相比，dsDNase無需額外加入EDTA進(jìn)行失活，不僅節(jié)省實(shí)驗(yàn)時間，而且降低了對逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的抑制。All-in-OneFirst-Strand Synthesis MasterMix (with dsDNase)作為升級后的一鏈cDNA合成試劑盒，15分鐘內(nèi)最長可獲得12 kb cDNA。

可依據(jù)基因組污染嚴(yán)重程度選擇采用去基因組DNA污染與反轉(zhuǎn)錄分開進(jìn)行的操作方法，或者去基因組污染與反轉(zhuǎn)錄一步法進(jìn)行的操作方法。

使用方法：

針對基因組含量低的RNA樣品(推薦方案)

①于冰上配制如下反應(yīng)體系：

a. 推薦采用試劑盒提取的 RNA 作為模板

② 輕柔吸打混勻，瞬離；

③ 37℃溫育2min，以去除基因組DNA污染；

④ 55℃溫育15 min;

⑤ 反應(yīng)結(jié)束后，85℃溫育5 min以終止反應(yīng);注：若RNA中基因組DNA污染嚴(yán)重，可適當(dāng)延長37℃溫育時間至5 min。

⑥ 迅速將獲得的 cDNA置于冰上，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn);或立即保存于-20°C。

針對基因組含量高 RNA 樣品

1. 基因組 DNA 污染去除

①于冰上配制如下反應(yīng)體系：

a. 推薦采用試劑盒提取的RNA作為模板。

② 輕柔吸打混勻，瞬離;

③ 37°℃溫育2 min，以去除基因組DNA污染;

注:若RNA中基因組DNA污染嚴(yán)重，可適當(dāng)延長37℃溫育時間至5 min。

④ 65℃溫育2 min，使dsDNase失活，冰上放置。

2. 第一鏈cDNA合成

① 于冰上配制如下反應(yīng)體系：

② 輕柔吸打混勻，瞬離；

③ 50℃溫育15min；

注：若目標(biāo)RNA不含Poly(A)結(jié)構(gòu)，可預(yù)先25℃溫育10min。

④ 反應(yīng)結(jié)束后，85℃溫育5min，以終止反應(yīng)；

⑤ 將獲得的 cDNA 溶液置于冰上，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

注：cDNA溶液置于-20℃儲存，建議不超過1周；置于-80℃可長期儲存。

注意事項(xiàng)

預(yù)混液中已經(jīng)包含Oligo(dT)₂₀VN和隨機(jī)引物，不僅適用于包含Poly(A)結(jié)構(gòu)的真核生物mRNA，也適用于不含Poly(A)結(jié)構(gòu)的原核生物RNA、真核生物rRNA和tRNA等模板，但不適用于miRNA等小RNA模板。