產品簡介

人成纖維細胞生長因子10（Fibroblast Growth Factor 10, FGF-10）又稱角質細胞生長因子2（Keratinocyte Growth Fatcor-2, KGF-2），屬于FGF家族，是一種約20kDa的蛋白質，在其N末端附近含有富含絲氨的區域。它分別與小鼠和大鼠FGF-10具有93%和96%的氨基酸序列同一性。FGF-10被認為在胚胎發生過程中很重要，也在脂肪生成中起著重要作用。FGF-10在前第二心區表達，與成纖維細胞生長因子8（FGF-8）一起促進形成心臟動脈極的心臟祖細胞的增殖。

翌圣Human FGF-10 ELISA(酶聯免疫吸附測定)試劑盒是一種體外酶聯免疫吸附測定試劑盒，用于定量測定血清、血漿和細胞培養上清中的FGF-10。特異性抗FGF-10抗體預包被在高親和力的酶標板上。酶標板孔中加入標準品、待測樣本，經過孵育，樣本中存在的FGF-10與固相抗體結合。洗滌去除未結合的物質后，加入檢測抗體孵育結合，經洗滌，再加入酶結合物(Streptavidin-HRP)孵育結合。洗滌后，加入顯色底物 TMB，避光顯色。顏色反應的深淺與樣本中FGF-10的濃度成正比。加入終止液終止反應，在450 nm 波長(參考波長570 - 630 nm)測定吸光度值。

產品信息

組分信息

儲存條件

試劑盒可全置于2~8℃保存，也可按照組分信息中保存條件將試劑依據要求存放，避免污染與反復凍融，稀釋成工作濃度試劑即用即棄，不可重復使用。有效期1年。

表1. 使用后試劑保存表

使用說明

1. 用于定量檢測血清、血漿和細胞培養上清中FGF-10含量。

2. 使用本品前，請詳細閱讀說明書。

注意事項

1. 本產品僅作科研用途。

2. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并佩戴一次性手套操作。

3. 試劑盒需在保質期內使用完畢。禁止不同批次的相關試劑進行混用。

4. 本產品僅能夠應用于檢測說明書中標注的靶點抗原與樣本。其它應用需經使用者設計驗證后，根據結果評估使用的可靠性與準確性。

5. 不要混合或替代其他試劑盒批次的試劑或材料的供應商。

常見技術提示

1. 樣本OD值高于S1 OD值時，應在適當的樣品稀釋液中進一步稀釋。

2. 混合時避免產生泡沫。

3. 在添加標準品、樣本和其他時，要及時更換槍頭，避免交叉污染。

4. 在孵育期間，保證酶標板適當密封或封板膜覆。

5. 請在清洗步驟中清除所有溶液和緩沖液。

6. 在溶解標準品之前，請勿將標準品管隨意倒置。當將標準品管倒置后，加入緩沖液后請充分上下混勻，然后低速離心。

7. 在實驗過程中，試劑按照說明書要求放置。

8. 在實驗完成后及時丟棄緩沖液，即用即棄。

9. 不同產品的試劑盒組分不同，不可交叉使用。

其他準備材料 

1. 酶標儀，在450 nm測量吸光度(參考波長630 nm)。

2. 恒溫箱、自動微孔洗板機。

3. 移液器，1 μL到1 mL移液槍與配套槍頭。

4. 100 mL和1 L刻度量筒。

5. 標準品或樣品稀釋試管。

6. 吸水紙。  

7. 蒸餾水或去離子水。

8. 計算機及分析軟件。

實驗前準備

1. 樣本收集與處理

1) 細胞培養上清：1,000×g離心10分鐘去除沉淀物，即刻檢測，或者分裝，-20℃以下保存。

2) 血清樣本：使用不含熱原和內毒素的試管收集血清。血樣凝集30分鐘后，1,000×g離心10分鐘。吸取血清樣本之后即刻檢測，或者分裝，-20℃以下保存。

3) 血漿樣本：EDTA、枸櫞酸或肝素抗凝收集血漿樣本。1,000×g離心30分鐘收集樣本。即刻檢測，或者分裝，-20℃以下貯存。

本試劑盒可能適用于其它生物學樣本。血清、血漿和細胞培養上清已經過驗證。

注意：檢測前，樣本中可見的沉淀必須去除。不要使用嚴重溶血或高血脂的樣本。樣本應分裝并貯存于-20℃，以避免FGF-10活性的丟失。如果在24小時內檢測，樣本可以存放在2-8℃，避免樣本的反復凍融。在檢測前，冷凍樣本應緩慢地恢復至室溫(25 ℃±3℃)，輕柔地混勻。

如果樣本需要稀釋，請使用的樣本緩沖液進行稀釋。

建議正常的血清/血漿樣本(僅供參考）：使用樣品稀釋液1：1稀釋

建議細胞培養上清(僅供參考）：原液

因樣本所含有目標蛋白的含量有差異，每個樣本的稀釋比例建議根據預實驗結果或按實際情況判定。

2. 酶標板準備

酶標板在使用之前需恢復室溫。 未使用的板條應及時放入干燥劑密封后儲存在2-8°C，建議每個樣本復孔實驗。

3. 試劑準備

使用前所有試劑組分以及待測樣本需要恢復室溫。為了保證實驗的準確性，請在使用前15分鐘內完成。

1) 1 ×洗液 配制：濃縮液平衡至室溫，充分溶解，不要有結晶。混勻，取25 mL 20×洗液至蒸餾水中，然后定容到500mL；具體配制體積，可按照每次使用量進行配制。

2) 檢測抗體 配制：使用離心20秒，然后用抗體稀釋液以1：100稀釋至工作濃度使用，如：取60μL定容至6mL 抗體稀釋液；具體配制體積，可按照每次使用量進行配制，充分混勻。

3) 酶結合物 配制：使用離心20秒，然后用酶稀釋液以1：200稀釋至工作濃度使用，如一次吸取30 μL，用抗體/酶稀釋液稀釋至6mL；具體配制體積，可按照每次使用量進行配制，充分混勻。

標準品曲線的制備：準備7個無菌的1.5mL離心管，按照標準品濃度依次進行標記。S1制備：取一支標準凍干品用樣品稀釋液按標簽標示量溶解，充分混勻，即標記其為64 ng/mL。各離心管分別加入300μL 1 ×樣品稀釋液，先取300μL S1，加至第一個離心管中充分混勻后，再取300μL至下一個標記濃度的離心管中，充分混勻，進行一列2倍梯度稀釋標準品，起始最高濃度標記為64 ng/mL，濃度為1 ng/mL，可按照下面的配制方法來進行。每次試驗均需制備相應的標準曲線，不同試劑盒以及不同時間的標準曲線不能混用。樣本測試時，每個孔所需標準品量為100μL，注意配制體積要高于所需體積，避免使用量不足。

表2. FGF-10標準品體系配制（1 - 64 ng/mL）

實驗方法

使用前所有試劑及待測樣本需要恢復室溫。強烈建議所有的標準品和待檢樣本進行復孔測定。

1.試劑準備：備好各種待測試劑、稀釋好的標準品和待測樣本。

2.酶標板條確定：計算待測樣本和標準品所需酶標板條，將酶標板條從鋁箔袋取出，剩余酶標板條放回鋁箔袋中并封好袋口，低溫保存。

3.浸泡酶標板：加入1×洗液(350 μL/孔)浸泡酶標板，靜置30秒后棄去孔中液體，拍干酶標板。液量對試驗結果有重要影響，確保最后一次拍板沒有洗液殘留。

4.加樣孵育：加入各梯度標準品和已稀釋待測樣本，100 μL/孔，確保15分鐘內完成點樣，室溫孵育2小時。

5.清洗酶標板：棄去孔中液體，加入1×洗液(350 μL/孔) 洗板5次，拍干酶標板。

6.檢測抗體孵育：將預先配制至工作濃度的檢測抗體加入酶標板中，100 μL/孔，室溫孵育2小時。

7.清洗酶標板：棄去孔中液體，加入1×洗液(350 μL/孔) 洗板5次，拍干酶標板。

8.酶結合物孵育：將預先配制至工作濃度的酶結合物加入酶標板中，100 μL/孔，室溫孵育20分鐘。

9.清洗酶標板：棄去孔中液體，加入1×洗液(350 μL/孔) 洗板5次，拍干酶標板。

10.顯色：使用前分鐘將底物液恢復至室溫，將底物液加入酶標板中，100 μL/孔，室溫避光孵育15分鐘。

11.終止：加入50 μL/孔終止液至酶標板中，此時顏色由藍轉黃，輕輕震動酶標板至顯色均勻。

12.讀值：10分鐘內讀取450 nm/630 nm的光吸收值。

標曲制定

計算標準品和樣本復孔的平均OD值，并減去空白孔的平均OD值作為校準OD值。以標準品濃度的對數為橫坐標，校準OD值的對數為縱坐標繪制標準曲線。多種繪圖和統計學軟件可以用于輔助繪制標準曲線并進行未知樣本濃度的計算。四參數擬合法往往擬合效果較好，其它方法如線性擬合也可能獲得較好擬合結果，需要根據具體實驗數據進行分析。

實驗數據

1. 標曲數據

數據擬合繪制標準曲線，生成的標曲用于實驗數據分析。

2. 靈敏度檢測

FGF-10的檢測限為0.69 ng/mL，通過使用重復檢測20次零孔OD值的均值與標準差計算得出。

3. 精密度檢測

酶標板內精密度

3個已知濃度的樣本酶標板內重復測定8次，評估酶標板內的精密度。

酶標板間精密度

3個已知濃度的樣本酶標板間重復檢測24次，評估酶標板間的精密度。

4. 回收率檢測

 通過不同水平的FGF-10添加于樣本中來測定回收率，其回收率如下:

5. 稀釋線性檢測

6. 樣本值

應用本試劑盒，檢測若干健康志愿者的樣本，志愿者的用藥史不詳。

n.d. 指樣本濃度值低于檢測范圍內得1 ng/mL

7. 測定特異性

本試劑盒識別天然和重組FGF-10，沒有觀察到明顯的交叉反應和干擾影響。

檢測簡圖

疑問解答